青霉素类抗生素是目前临床普遍使用的一类抗感染药物,由于其结构不稳定,易产生较多杂质,导致药效下降且产生较严重的过敏反应,因此对青霉素类抗生素的杂质谱控制是保障其用药安全的关键。杂质谱分析首先应使青霉素中可能存在的全部有关物质均得到较好的分离,由于其杂质种类较多,且性质差异较大,给HPLC分离增加了难度。目前中国药典共收录15个青霉素品种,这15种青霉素药物的有关物质分离方法存在两点不足:1)虽然青霉素具有相似的化学结构,但中国药典中收载的有关物质分析方法却存在较大差异,此“千药千法”的现状导致同一类型的药品分离出的杂质种类的差异较大,且相互之间没有可比性,建立分析方法费时费力;2)药典方法对一些青霉素品种有关物质的分离效果不佳,不能分离出所有的有关物质,且个别存在较严重的色谱峰拖尾现象。为解决以上两点问题,尝试采用相似的色谱系统(固定相相同、流动相组成相同,比例对不同品种略有差异)分离青霉素类抗生素。如果一个分析方法能使多种青霉素的有关物质取得较好分离,则此方法可成为一种普适性方法,作为建立不同青霉素类抗生素杂质谱的基础,在普适性方法的基础上,根据不同品种的特点对方法进一步优化,得到其最优分离方法。基于实验室的前期工作,已经证明2015版中国药典中青霉素钠的有关物质分析方法对多数青霉素品种的分离具有普适性。需要进一步解决的问题是如何对普适性方法进一步优化,得到具体品种的最优分离方法,并总结出对普适性方法优化的共性原则,从而完善利用普适性方法分离青霉素类抗生素的策略。质量源于设计(Quality by Design,Qb D)理念已经在分析方法的建立、优化中有广泛的应用,称之为AQb D(Analytical Quality by Design)理念。实验设计(Design of Experiment,Do E)作为AQb D理念的重要组成部分,可同时考察多个影响因子及不同影响因子的交互作用,并根据统计学,科学地对实验各个阶段进行风险评估,可得到满足实验目的的设计空间(Design Space,DS),保证方法的稳健性,是分析方法优化的未来趋势。本论文以青霉素V钾、苯唑西林、氯唑西林为例,基于AQb D理念,用Do E对这3个青霉素品种的最优分离方法进行优化;根据优化的过程与结果,探讨在普适性方法的基础上,针对不同品种优化其最优分离方法的一般过程,总结优化过程的共性,为优化其他青霉素品种提供参考。最终优化后的方法对上述3个品种青霉素有关物质的分离均得到理想的效果,与现行中国药典方法比较,可分离出更多的杂质,且色谱峰的对称性更好。在优化过程中详细论述了Do E的过程,最终结果证明通过Do E可以建立稳健的分析方法,相比于传统的试错法,Do E具有更科学、对影响因子的考察更加全面,更节约经济成本等优势。对优化后的方法进行方法学验证,证明方法具有较好的耐用性、精密度、准确性和重复性。之后对杂质谱中有关物质结构进行鉴定。首先根据青霉素的降解反应机理推测上述3个青霉素品种中可能出现的所有降解产物结构,为之后的杂质结构解析工作提供指导;之后用LC-MS对杂质峰结构进行解析,根据杂质的分子量,二级质谱信息,结合质谱裂解规律和UV光谱特征,逐一推断杂质峰结构;并将实际检测出的杂质与推断出的可能降解产物进行比较,以此判断通过极端条件得到的降解杂质是否全面,推导的杂质是否全部存在于实际降解样品中,通过这样的方式,将有关物质的结构鉴定提前至实验设计阶段,更符合AQb D理念,且对可能存在的杂质有大致的了解,有利于之后实验的进行。最后用优化后的方法对三个青霉素品种的实际样品进行分析,发现实际样品中的杂质可得到较好分离,方法可以有效控制产品质量。