果树抗逆性是苹果育种的一个重要目标。果树的抗逆性主要体现在逆境胁迫下。非生物胁迫属于一种逆境胁迫,在各种非生物胁迫中,低温胁迫无疑是全球范围内最复杂和最具破坏性的。低温作为一种常见的非生物胁迫,其影响果树生长,开花,结果,也制约着果树的生长发育以及果实产量。因此,果树对低温的耐受程度就显得尤为重要。SWEET蛋白是一类糖转运蛋白,大多数包含两个MtN3基序,有的包含一个MtN3基序。SWEET蛋白在植物生长发育进程和响应外界环境刺激中起着重要作用。近几年,对SWEET蛋白研究有所增多,尤其是在糖转运,花粉管形成与成长和逆境胁迫等方面,然而对SWEET蛋白响应低温胁迫的研究还较少。为了进一步发掘SWEET蛋白的功能和响应低温胁迫的重要作用,本研究以王林愈伤组织为试材,低温处理后,通过对25个苹果中SWEET基因表达差异的筛选,克隆了一种SWEET糖转运蛋白基因,并对基因功能验证等方面开展研究,主要结果如下:1.低温处理王林苹果愈伤组织,通过对25个SWEET蛋白家族基因做实时荧光表达量分析,进行差异筛选。RT-qPCR结果显示MdSWEET16的表达量在低温条件下显著上调。所以本研究将具有显著表达差异的MdSWEET16作为目的基因进行进一步的功能验证。2.为了进一步确保基因表达差异筛选结果的准确性,我们进行系统进化树分析,发现MdSWEET16与拟南芥AtSWEET16和AtSWEET17同属一个进化树分支。并且进行保守结构域分析,发现MdSWEET16与拟南芥AtSWEET16和AtSWEET17中都含有6个相似的保守结构域。MdSWEET16位于2号染色体上,由6个外显子和5个内含子组成。3.我们测定了美红苹果发育期MdSWEET16的相对表达量,测定结果表明,随着果实的发育,MdSWEET16的相对表达量减少。4.将MdSWEET16在王林苹果愈伤组织中过表达,然后低温处理四种愈伤组织,包括过表达MdSWEET16型,野生型,过表达带GFP标签的空载体型和RNAi型王林苹果愈伤组织。观其表型,测其鲜重,发现过表达MdSWEET16王林苹果愈伤组织在低温条件下比野生型,过表达带GFP标签的空载体型愈伤组织的长势较好;抑制表达MdSWEET16王林苹果愈伤组织在低温条件下比野生型,过表达带GFP标签的空载体型愈伤组织的长势较弱。不同温度下测定四种愈伤组织相对电导率,发现低温条件下过表达MdSWEET16王林苹果愈伤组织的相对电导率低于野生型,过表达带GFP标签的空载体型愈伤组织;抑制表达MdSWEET16王林苹果愈伤组织的相对电导率高于野生型,过表达带GFP标签的空载体型愈伤组织。对SOD,CAT,POD等与逆境胁迫相关酶活性的测定,发现当温度变低时过表达MdSWEET16王林苹果愈伤组织与野生型,过表达带GFP标签的空载体型愈伤组织相比,SOD,CAT酶活性的下降率较小;抑制表达MdSWEET16王林苹果愈伤组织与野生型,过表达带GFP标签的空载体型愈伤组织相比,CAT,POD酶活性的下降率较大。对MdCBF1,MdCBF2,MdCBF3,MdRD29A这几个与低温胁迫相关转录因子基因表达量分析,发现MdCBF3在过表达MdSWEET16王林苹果愈伤组织中的表达量明显高于野生型,过表达带GFP标签的空载体型愈伤组织;MdCBF3在抑制表达MdSWEET16王林苹果愈伤组织中的表达量低于野生型,过表达带GFP标签的空载体型愈伤组织。结果发现,过表达MdSWEET16王林苹果愈伤组织对低温的耐受性要高于其它三种愈伤组织。5.在过表达MdSWEET16的王林苹果愈伤组织中对MdSWEET16蛋白进行亚细胞定位,发现其定位在液泡膜上。通过原核诱导获得重组蛋白,其大小约为30kDa。利用生物信息学分析MdSWEET16蛋白的跨膜结构域,发现其存在7个保守跨膜螺旋。本研究表明MdSWEET16能够响应低温,并能够影响与逆境胁迫相关酶的活性,同时也增强了王林苹果愈伤组织对低温的耐受性。