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牛支原体（Mycoplasma bovis）是感染牛的一种重要的致病性病原体,主要引起牛的肺炎和乳腺炎等多种疾病[1]。美国在1961年首次从患乳腺炎的牛乳中分离到该病原[4]。国内是在2008年首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离到Mb,此后在国内开始蔓延。目前该病原在国内外传播广泛,造成了巨大的经济损失。在综合前期分析研究的基础上,本文系统开展了抗体消长规律、T细胞亚群、T淋巴细胞免疫特性以及细胞因子等基础性研究分析,旨在丰富牛支原体免疫原性研究内容,为进一步筛选优势菌株提供理论参考,也为后续Mb免疫机制和致病机理的探讨、诊断试剂盒研发、疫苗研制等进一步研究奠定理论基础。1牛支原体菌株复苏、增殖培养、PCR鉴定以及浓度测定本试验采用自主改良的支原体培养基对前期筛选的3株Mb菌株进行复苏、增殖培养,通过基于M.b保守oppD/F基因设计的特异性引物进行PCR扩增鉴定,并采用液体培养颜色变化单位（CCU）法对菌液进行浓度测定。研究发现M.b在自主改良的Eton’s液体培养基上生长良好,培养时间有效得到缩减,培养24h后培养基开始变色,而48h后菌落即可达到对数生长期；3株菌株菌液浓度均达109CCU/mL以上；建立的Mb PCR鉴定方法特异性好、灵敏度高、操作简单。2牛支原体接种小鼠后机体抗体消长规律的研究为了确定3株牛支原体菌株在小鼠体内抗体动态变化水平,选择优势菌株,本试验采用ELISA方法,测定了接种小鼠后不同时间段小鼠机体抗体,并分析其消长规律。结果显示,三株牛支原体菌株接种后均能引起小鼠机体抗体水平的增长,并呈现规律性下降,其中在攻毒后第一周,W70组抗体水平显著高于1738组和Q3组（P<0.01）；攻毒后的第二周,w70组抗体水平>Q3组抗体水平>1738组抗体水平,三组彼此之间的抗体水平差异均极显著（P<0.01）；攻毒三周后各组抗体水平开始下降,差异显著。虽然三株菌株在接种后第一周均产生抗体,但1738株菌株相对W70,Q3两株菌株在后期的抗体水平增加速度缓慢,抗体峰值水平也相对不明显。而W70,Q3两株菌株均在接种后第二周抗体水平达到峰值,随后抗体水平逐渐下降,最后趋于恒定变化。其中W70株产生抗体较为明显,不仅产生速度较快而且产生的抗体滴度较高,可作为后备疫苗制作参考菌株。3牛支原体接种小鼠后机体T细胞亚群的研究通过观察感染牛支原体小鼠CD4+/CD8+值的变化,为进一步探讨其免疫机制提供依据。本试验将120只Balb/C小鼠随机分为四组,分别接种不同菌株（W70菌株、Q3菌株、1738菌株、对照组）并在0d,7d,14d,21d,28d,35d采集外周全血,流式细胞检测仪检测T细胞亚群,计算CD4+/CD8+值。结果显示小鼠接种牛支原体后CD4+细胞数量均上升,CD8+细胞含量下降,CD4+/CD8+比值分别在第一、二周达到最大值后开始下降,其中,W70菌株在攻毒后第二周达到最大值,与其他三组差异极显著,其他两组之间差异不显著。其CD4+/CD8+比值升高明显说明在接种牛支原体菌株后,W70菌株较其他两株菌株能更能促进机体外周血淋巴细胞增殖活化,增强机体的细胞免疫功能,发挥免疫作用。同时也为我们了解牛支原体在动物机体内其CD4+、CD8+淋巴细胞在识别抗原和细胞免疫中的机理和作用提供理论参考。4牛支原体接种小鼠后机体T淋巴细胞免疫特性的研究采用E-玫瑰花环试验检钡（?）Balb/C小鼠的细胞免疫状况。试验结果显示,各组在接种后均能提高花环形成率,其中在接种后14天,W70菌株组的玫瑰花环形成率最高为22%,最低也是在35d后,其花环形成率为13%,说明三株M.b菌株中W70菌株更能刺激机体免疫应答,增强机体细胞免疫功能,促进淋巴细胞的增殖和分化。5牛支原体接种小鼠后机体细胞因子变化的研究为了探讨白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏因子-a （TNF-a）在Balb/C小鼠体内的表达及其与病情严重程度的关系,本试验选择三株牛支原体菌株接种Balb/C小鼠,分别在不同时间段采集凝血分离血清,采用ELISA法检测3组IL-1、IL-6、TNF-a细胞因子含量和探讨在机体内表达情况。结果显示,牛支原体感染小鼠后血清中IL-1、IL-6及TNF-a水平明显升高,与对照组差异显著；血清中IL-1、IL-6及TNF-a水平增高,表明细胞因子IL-1、IL-6及TNF-a参与了牛支原体肺炎的发生、发展,且与疾病的感染程度紧密相关。其中W70组IL-6、TNF-a水平显著高于Q3组合1738组,说明W70菌株更能刺激机体产生炎症反应,促进T、B淋巴细胞增殖活化分泌相关炎性细胞因子。6牛支原体接种小鼠后脏器指数变化的研究通过研究牛支原体对小鼠脏器指数（肺脏指数,脾脏指数和胸腺指数）的变化,探讨牛支原体对机体感染部位以及免疫器官的影响。结果表明,在Mb感染Balb/C小鼠实验中,与对照组相比各试验组小鼠脾指数和胸腺指数变化与对照组差异极显著（P<0.01）。但是试验组之间差异不显著,因此我们不难得出,不同Mb菌株感染小鼠后机体虽然均产生了不同程度的免疫清除作用,反应出各菌株毒力大小,但不能准确判定免疫原性强弱,需要结合抗体、细胞免疫等试验加以综合得出结论。本试验研究表明,Balb/C小鼠接种牛支原体后能增加小鼠脏器指数,提高体液免疫作用,增强细胞免疫功能,促进炎性细胞因子的产生,间接性促进小鼠机体的免疫功能,刺激小鼠增强适应外界病原物质侵袭的免疫能力。