肺炎克雷伯氏菌属于肠杆菌科克雷伯氏菌属,是造成院内感染的主要病原菌之一。在我国,其感染率仅次于大肠杆菌,主要引起肺炎、败血症、尿路感染等疾病。近年来,随着抗生素的大量使用,特别是头孢菌素、碳青霉烯类等抗生素的泛滥使用,导致严重的耐药形势形成,尤其是多重耐药和广泛耐药菌的出现,致使肺炎克雷伯氏菌感染疾病面临药物选择困难甚至无药可用的严峻局面。其中β-内酰胺类水解酶已成为肺炎克雷伯氏菌的主要耐药机制。面临如此严峻的形势,快速准确地鉴定出肺炎克雷伯氏菌及其携带的β-内酰胺类耐药基因对指导临床用药和及时治疗患者具有重要意义。目前临床上进行细菌鉴定和耐药检测以表型检测方法为主,主要包括传统手工鉴定与药敏实验方法。该方法虽然易操作、成本低,但耗费大量的时间,且影响因素较多,故本次研究从分子生物学角度探索鉴定肺炎克雷伯氏菌及其携带的β-内酰胺类耐药基因的方法,建立了基于PCR和LAMP检测肺炎克雷伯氏菌的方法,并利用单重PCR和多重PCR进行β-内酰胺类耐药基因的检测。研究首先对肺炎克雷伯氏菌基因组进行生物信息学分析,根据种间特异和种内共有的原则,筛选出两个特异基因:ureR1（GenBankID:11847803）和CelB（GenBankID:11847805）。以这两个基因为靶基因,分别建立了 LAMP和PCR的鉴定体系。以36株肺炎克雷伯氏菌临床分离株和其他五种肺炎克雷伯氏菌进行特异性评估,两种鉴定方法均可特异性区分肺炎克雷伯氏菌与非肺炎克雷伯氏菌;利用十倍系列稀释的阳性质粒和模拟感染血液样本进行灵敏度评估,结果显示灵敏度均能达到1个拷贝/反应。通过在线耐药基因数据库（ARDB）查找,发现肺炎克雷伯氏菌主要存在16种β-内酰胺类耐药基因。于NCBI下载16种耐药基因所有亚型基因,进行多序列比对寻找共有序列,设计相应的引物。通过PCR检测,在69株临床菌株中发现11种β-内酰胺类耐药基因。十倍系列稀释的阳性质粒被用于耐药基因的灵敏度评估,结果显示 ndm、cwy、ctx-m、tem、shv、act、oxa、okp、kpc、imp10 个耐药基因的灵敏度均能达到1个拷贝/反应,耐药基因dha的灵敏度能达到10个拷贝/每反应。证明1 1种耐药基因的鉴定体系均具有很高的灵敏度。经过PCR验证,69株临床菌株的耐药表型和基因型是基本匹配的。根据两个特异基因和1 1个耐药基因建立多重PCR鉴定体系,其中特异基因ureR1和6个耐药基因dha、ndm、ctx-m、tem、shv的检测组合在一个多重PCR体系,特异基因CelB和5个耐药基因act、oxa、okp、kpc、imp的检测组合在一个多重PCR体系。该多重PCR体系能成功检测混合阳性质粒、基因组以及模拟感染血液样本裂解液中的13个基因,检测结果与单重PCR一致。其检测下限能达到102拷贝/反应,具有较高的特异性和灵敏度。综上所述,本次研究基于PCR和LAMP方法见了了肺炎克雷伯氏菌快速鉴定方法,用于菌种鉴定的两个特异基因均为首次使用,同时对其携带的β-内酰胺类耐药基因建立鉴定体系。并进一步将肺炎克雷伯氏菌鉴定及其携带的β-内酰胺类耐药基因检测整合为多重PCR检测体系,在很大程度上节约了时间,具有直观、简单、快速、灵敏度和特异性高等特点。