论文部分内容阅读
家蚕作为具有重要经济价值的鳞翅目模式昆虫,在世界的文化传播、经济和社会的发展中发挥了重要作用。然而每年因蚕病引起的损失占蚕业总生产的比例高达25%。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclearpolyhedrovirus, BmNPV)是蚕业上危害最严重且最常见的一类病原微生物。随着1999年对BmNPV全基因组序列测定的完成,BmNPV的侵染增殖分子机制的研究逐渐深入。本研究利用家蚕内源性的microRNA骨架,采用RNAi技术,筛选及鉴定BmNPV增殖复制的关键基因。主要研究结果如下：1. BmNPV增殖复制相关基因的筛选与克隆根据文献报道的杆状病毒基因功能分析,初步筛选与BmNPV增殖复制相关的34个基因进行克隆。其中参与病毒DNA复制的基因有9个,参与病毒BV产生的基因有28个,与核衣壳产生相关的基因有12个,影响晚期基因表达的基因有8个,影响极晚期基因表达的基因有7个。2. BmNPV增殖复制关键基因的鉴定从已初步筛选的34个基因中最终筛选8个候选基因作为后续实验的研究对象。这8个基因分别是：dbp、lef2、lef3、lef7、lef10、lef11、p143、vp1054。分别构建这8个基因对应的干涉载体和荧光素酶载体,转染BmN-SWU1细胞。转染细胞48h后测酶活,发现lef2和lef11的抑制效果达到90%以上,dbp、lef3、 p143、vp1054抑制效果达到80%以上,而lef10抑制效果只有12.4%,lef7没有抑制效果。在病毒的感染率统计实验中,pIZ-DsRed-milef11转染的细胞中病毒的感染率仅为9.16%,pIZ-DsRed-milef10病毒感染率为26.2%,pIZ-DsRed-midbp、pIZ-DsRed-milef3病毒感染率分别为58.4%和54.6%,pIZ-DsRed-mip143和pIZ-DsRed-mivp1054病毒感染率分别是71.1%和67.3%,而pIZ-DsRed-milef2, pIZ-DsRed-milef7感染率达到了100%。以上结果表明在本研究所筛选的8个候选基因,lefll是BmNPV增殖复制的关键基因。3.不同启动子驱动的同一干涉载体对病毒增殖复制的影响将筛选的7个活性不同的启动子A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70分别替换pIZ-DsRed-milef11中的IE2启动子,并将构建的干涉载体转染BmN-SWU1细胞,转染细胞48h后测酶活。A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、 hr3A4、hsp70干涉载体对lefll基因的抑制效果分别是92.6%、97.9%、96.9%、94.8%、95.3%、96.8%、97.9%。在病毒的感染率统计实验中,A4、IE1、IE1-295、 IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70干涉载体转染的细胞中,病毒的感染率分别是18.1%、8.34%、8.41%、11.1%、11.9%、12.1%和11.8%。干涉效果以及对病毒增殖复制的影响结果分析表明IEl启动子是筛选的7个启动子中最优化的启动子,其驱动的pIZ-DsRed-milef11干涉载体也是本研究中最优化的干涉载体。