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第一部分 大鼠SAH后脑组织中GSNOR及蛋白质S-亚硝基化的表达水平变化与早期脑损伤关系的研究目的:研究大鼠蛛网膜下腔出血(SAH)后不同时间点脑组织中GSNOR蛋白表达水平和活性变化,以及相关产物(NO、GSNO)在脑组织中的含量变化,同时检测SAH后蛋白质S-亚硝化的水平改变,确定干预时间点。通过过表达慢病毒转染技术升高大鼠脑组织GSNOR水平后观察其对早期脑损伤后神经元凋亡和神经行为学预后的影响。方法:实验1:100只大鼠随机造模,其中SAH后存活70只(n=10/组):Sham、SAH(3、6、12、24、48、72 h)。采用比色法检测 GSNOR活性及 NO和GSNO含量。此外,通过Western blot检测GSNOR和PSNOs的时间表达。此外,10只Sham和10只SAH(12小时)大鼠用于PSNOs染色。实验2:140只大鼠随机分组,其中SAH后存活88只(n=22/组):Sham、SAH12h、SAH12 h+慢病毒 CON355(LV-CON335)、SAH 12h+慢病毒 GSNOR(LV-GSNOR)组。比色法检测GSNOR活性及NO、GSNO含量(n=8/组)。Western blot检测GSNOR的时间表达,免疫荧光染色检测GSNOR在SAH后神经元中的定位(n=8/组)。TUNEL染色用于检测神经元凋亡(n=6/组)。实验3:57只大鼠随机分组,其中45 只在 SAH 后存活至 26 天:Sham(n=12)、SAH(n=11)、SAH+LV-CON335(n=10)、SAH+LV-GSNOR(n=12)组。改良加西亚评分、平衡木平衡测试和平衡木行走测试用于短期行为评估。转棒测试、改进的贴纸测试、水迷宫和探针试验用于长期行为评估。最后处死大鼠进行尼氏染色以检测神经元损伤。结果:实验1:1、与假手术组相比,SAH后3小时脑组织中NO和GSNO水平开始升高。随着时间的推移,在6至12小时,GSNO水平继续上升,而NO水平逐渐下降并保持稳定,但仍高于基线水平。2、Western blot和酶活性检测结果显示,脑组织中GSNOR的表达水平和活性随着NO和GSNO浓度的增加而显著降低,并在SAH后12小时达到最低点。3、SAH后12小时,颞底皮层中的S-亚硝基化蛋白质表达增加。这些结果表明,SAH后12小时这个时间点可能是在进一步实验中干预GSNOR表达的最合适时间。实验2:1、免疫荧光共染的结果表明,GSNOR主要在大鼠颞底皮层区域的神经元细胞上分布,且分布水平变化与Western blot的结果相一致。2、Western blot及免疫荧光共染的结果表明,过表达GSNOR的慢病毒转染可以提高脑组织中GSNOR的表达水平。然而,随着GSNOR表达的增加,GSNOR的酶活性并没有显著增加。3、随着GSNOR表达的增加,GSNO水平显著下降但对NO水平影响不大。4、TUNEL染色结果显示:SAH后颞底皮层神经元凋亡明显增加,而过表达GSNOR可以有效减少神经元凋亡。实验3:1、与阴性对照组相比,过表达GSNOR可以显著改善大鼠Garcia评分,延长大鼠跌落平衡木及掉落转棒的潜伏期,明显缩短大鼠通过平衡木及去除前爪贴纸的时间以及有效改善大鼠的空间学习与记忆能力。2、Nissl染色结果显示:SAH后颞底皮层和海马CA1区形态正常的神经元数量明显减少,而过表达GSNOR可以有效减少神经元损伤。结论:1、大鼠SAH后,脑组织中GSNOR表达水平及活性下降,且在12h时最明显;2、在诱导SAH后,NO和GSNO的产生增加会导致蛋白质S-亚硝基化水平升高;3、过表达GSNOR可以降低SAH诱导后的GSNO水平;4、过表达GSNOR减少SAH后的神经元凋亡;5、过表达GSNOR可以改善SAH诱导后的短期和长期神经行为学结果。第二部分 GSNOR调控Drp1的S-亚硝基化对线粒体相关性神经元凋亡的影响目的:在体外实验中研究GSNOR调控Drp1的S-亚硝基化水平变化及对SAH后早期线粒体相关性神经元凋亡的影响。方法:将提取的原代神经元分为四组:对照组、OxyHb 6h、OxyHb 6h+LV-CON335、OxyHb 6h+LV-GSNOR组。进行免疫荧光染色以测试神经元中GSNOR的定位(n=25)。ATPB(线粒体标记)的免疫荧光染色用于分析线粒体片段化(n=25)。Western blot 检测 GSNOR、Drp1、SNO-Drpl、Phospho-Drp1 和 caspase-9的时间表达(重复3次)。Hoechst染色用于检测神经元凋亡(重复3次)。结果:1、免疫荧光共染的结果表明,GSNOR定位于大鼠神经元,与体外结果一致,且分布水平变化与Western blot的结果相一致。2、过表达GSNOR增加了原代神经元中GSNOR的表达水平。3、线粒体染色分析结果表明,SAH后神经元的线粒体碎片增加,而过表达GSNOR显著降低线粒体片段化程度。4、Drp1、SNO-Drp1和磷酸化Drp1-S616的Western blot结果显示:SAH后6小时,Drp1的S-亚硝基化和磷酸化水平均增加,且由GSNOR上调所引起的NO、GSNO产量减少会影响Drp1的S-亚硝基化。5、caspase-9的Western blot结果显示:SAH后6小时,cleaved caspase-9/pro-caspase-9的比值增加,而过表达GSNOR慢病毒组的比值低于阴性慢病毒组。6、Hoecbst染色结果显示,SAH后整个细胞核中高亮细胞核的比例高于假手术组,而过表达GSNOR慢病毒组与阴性慢病毒组相比显著降低。结论:1、过表达GSNOR减少线粒体片段化;2、过表达GSNOR通过降低Drp1的S-亚硝基化调节线粒体相关的神经元凋亡。