论文部分内容阅读
随着免疫疗法在肿瘤治疗上的广泛应用,嵌合抗原受体T细胞（Chimeric antigen receptorTcell,CART）疗法也随之进入人们的视野中。CART的出现使T细胞可以识别特定分子后实现非主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex,MHC）和共刺激信号依赖性活化,为一些肿瘤的靶向治疗奠定了基础,在肿瘤治疗中起到至关重要的作用。靶向人CD19的CART疗法对于血液瘤的临床治疗已获批上市,但是CART疗法对实体瘤的治疗效果仍不理想。肿瘤组织内存在着一定数量的肿瘤浸润性T细胞（Tumor-infiltrating T lymphocyte,TIL-T）,其具有识别肿瘤细胞特异性抗原的T细胞抗原受体（T cell receptor,TCR）,能够对肿瘤细胞产生特异性杀伤。在对肿瘤的过继性细胞治疗中,将TIL-T细胞回输至荷瘤小鼠体内,对肿瘤起到消退作用。但是,肿瘤微环境的特殊性限制了 TIL-T细胞的活化,从而使TIL-T细胞很难对实体瘤起到有效的治疗作用,导致TIL-T细胞在临床应用上存在一定局限性。因此,本课题将CART技术与TIL-T细胞的优势有机结合,构建新型TIL CD19-BBζ CAR-T细胞,并探讨其在治疗实体瘤中的效应作用。第一部分:CD19-BBζCART细胞的构建与功能鉴定目的:构建包含抗人CD19分子的单链抗体可变区（Single-chainfragment variable,scFv）、小鼠cd8分子的铰链区和跨膜区、小鼠4-1bb和cd3ζ链的胞内域依次串联组成的所有基因片段的重组质粒（简称CD19-BBζCAR）,并制备CD19-BBζCART细胞,验证其对肿瘤细胞的杀伤效应。方法:（1）利用基因工程技术,构建CD19-BBζ CAR的MSCV重组表达载体并对其进行测序验证;利用脂质体3000（Lipofectamine 3000）将CD19-BBζCAR重组质粒和逆转录病毒包装辅助质粒共转染platE细胞,包装获得CD19-BBζ CAR逆转录病毒,经浓缩后感染NIH/3T3细胞,利用流式细胞分析（Flow cytometry assay,FCA）检测其阳性率,计算病毒滴度;利用表达CD19-BBζ CAR的逆转录病毒感染小鼠脾脏来源的原代T细胞,构建CD19-BBζCART细胞;（2）构建表达人CD19分子（hCD19）的MSCV重组表达载体并对其进行测序验证,包装获得hCD19过表达的逆转录病毒,分别感染小鼠骨肉瘤细胞株K7M2和结肠癌细胞株CT26,构建稳定表达人CD19分子的基因转染细胞株hCD19+-K7M2和hCD19+-CT26;（3）将 hCD19+-K7M2 和 hCD19+-CT26 细胞分别与 CD19-BBζ CAR T 细胞共培养 12 h后,通过显微镜观察、杀伤检测试剂和FCA检测,分析CART细胞对目标肿瘤细胞的杀伤效应。结果:（1）经测序验证,成功构建了表达CD19-BBζCAR和hCD19的重组质粒;（2）CD19-BBζCAR包装的逆转录病毒经浓缩后,稀释810倍感染NIH/3T3细胞阳性率为31.4%,计算病毒滴度为1.28×108/mL;（3）FCA检测hCD19+-K7M2和hCD19+-CT26两种细胞系CD19的表达率分别为96.4%和94%;CD19-BBζ CAR T 细胞 CAR 分子表达率为 38.2%;（4）CD19-BBζ CAR T 细胞对 hCD19+-K7M2和hCD19+-CT26两种细胞具有特异性的杀伤功能,其中CD8+CD19-BBζ CAR T细胞能够产生更多的γ干扰素（Interferon-γ,IFNγ）和肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor α,TNFα）。结论:成功构建了 CD19-BBζ CAR和过表达hCD19的重组质粒及CD19-BBζCAR T 细胞和 hCD19+-K7M2、hCD19+-CT26 两种基因转染细胞株,CD19-BBζ CAR T细胞对hCD19+-K7M2和hCD19+-CT26两种肿瘤细胞株具有特异性的杀伤效应,为后续体内研究奠定了基础。第二部分:TIL CD19-BBζCAR-T细胞在结肠癌荷瘤小鼠中的抗肿瘤效应研究目的:构建肿瘤 TIL 来源的 CD19-BBζ CAR-T（TIL CD19-BBζ CAR-T,简称TILCAR-T）细胞,评价TILCAR-T细胞在结肠癌荷瘤小鼠体内的抗肿瘤效应。方法:CD19-BBζCAR逆转录病毒感染肿瘤来源的TIL-T细胞,构建TIL CAR-T细胞;利用hCD19+-CT26结肠癌细胞株构建荷瘤小鼠模型,肿瘤长出后,过继细胞治疗前48 h,荷瘤小鼠腹腔注射环孢霉素A（100 mg/kg）后随机分为5组,分别为:PBS、1×106个正常小鼠脾脏来源的MSCV-GFP空载病毒（mock）感染的对照T细胞（mock T）、1×106个正常小鼠脾脏来源的CD19-BBζCART（CAR T）细胞、1×106个荷瘤小鼠来源的MSCV-GFP空载病毒（mock）感染的对照TIL-T（mock TIL-T）细胞,1×106个荷瘤小鼠 TIL-T 细胞来源的 CD19-BBζCAR-T（TIL CAR-T）细胞。尾静脉回输细胞7天后,处死小鼠进行以下检测与分析:（1）剥离肿瘤,测量肿瘤大小;（2）肿瘤组织进行冰冻切片,苏木精-伊红（Hematoxylin andeosin,H＆E）染色法分析肿瘤组织的病理变化;（3）TUNEL染色分析肿瘤组织内细胞的凋亡情况;（4）免疫荧光染色分析肿瘤组织内CD8+T细胞和CD4+T细胞的浸润情况;（5）FCA分析外周血和脾脏中T细胞比例;（6）FCA分析小鼠脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞中记忆性T细胞比例和T细胞耗竭分子-免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域 3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain 3,Tim3）的表达情况;（7）FCA检测脾脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞的IFNγ和TNFα的表达情况;（8）H＆E染色分析治疗后荷瘤小鼠肾脏、心脏、肺的组织学变化。结果:成功构建TIL CAR-T细胞,将其回输至结肠癌荷瘤小鼠体内发现:（1）TIL CAR-T细胞具有更强的抑制肿瘤生长的能力;（2）TIL CAR-T细胞改善肿瘤微环境;（3）TIL CAR-T细胞促进肿瘤组织内部分细胞凋亡;（4）TIL CAR-T细胞具有更强的肿瘤浸润能力;（5）TILCAR-T细胞提高小鼠体内外周血和脾脏中T细胞比例;（6）TILCAR-T细胞提高脾脏中T细胞的杀伤能力;（7）TIL CAR-T细胞提高脾脏中记忆性T细胞的比例;（8）TIL CAR-T细胞治疗的小鼠脾脏中T细胞耗竭分子-Tim3表达比例下降;（9）TIL CAR-T细胞回输治疗未对小鼠关键脏器造成病理性损伤,生物安全性良好。结论:成功构建TIL CAR-T细胞,将其回输至荷瘤小鼠体内明显抑制了小鼠肿瘤的生长,促进了肿瘤组织内部分细胞的凋亡及CD4+T和CD8+T细胞向肿瘤组织的浸润,为T细胞成功浸润到肿瘤内部发挥作用提供了先决条件;同时TIL CAR-T有助于记忆性T细胞的形成及T细胞上耗竭分子Tim3表达的下调,并且生物安全性良好。