细胞中受到外界DNA损伤物质的侵害后会激活自身修复DNA的途径来进行DNA的损伤后修复,这是许多诱导DNA损伤药物发生耐药或剂量升高的重要原因之一。通过降低细胞内部的DNA损伤后修复水平来增敏DNA损伤药物是寻找放疗、化疗增敏剂可行的方法。细胞在接受DNA损伤因素的作用后是否能够存活主要取决于DNA双链断裂程度。ATM/ATR等PIKKs成员在应答DNA损伤、维持基因组稳定性过程中扮演重要的角色,它们传递基因组损伤的信号、阻滞细胞周期进程并且促进DNA修复。ATM主要对DNA双链断裂进行应答,下游最重要的底物是Chk2；ATR对DNA单链断裂、交联或者复制叉进行应答,下游的重要底物有Chk1和BRCA1等。Chk1和Chk2都将细胞阻滞在G2／M期,抑制DNA复制,促进受损的DNA进行修复。力达霉素(lidamycin, LDM;又名C-1027)是烯二炔类(enediyne)抗肿瘤抗生素家族的成员之一,通过诱导DNA断裂可以达到强烈的肿瘤细胞杀伤作用,在中国正在进行Ⅱ期临床试验。作为一种DNA损伤药物,力达霉素同样能够激活细胞内的DNA损伤修复通路,这可能是影响其疗效的主要原因之一。Hsp90是人们非常关注的治疗肿瘤的一个靶点,目前有多种Hsp90抑制剂正在进行临床试验,单独的Hsp90抑制剂并不能发挥很好的效果,但研究中发现Hsp90抑制剂与很多种化疗药物联合应用效果良好,能够起到增敏的作用。关于Hsp90抑制剂增敏化疗药物的机制众说纷纭,可能根据化疗药物的不同,Hsp90所抑制的通路所起的作用也不尽相同。其中许多研究证实Hsp90抑制剂可以降低基因组的稳定性。本研究主要研究了Hsp90抑制剂格尔德霉素及其衍生物CNDG与力达霉素联合给药后对力达霉素在人卵巢癌SKOV-3细胞中的增敏作用,观察联合给药后细胞的生长、增殖、DNA损伤水平,探讨Hsp90抑制剂对力达霉素增敏的作用机制。Hsp90抑制剂我们选择了典型的格尔德霉素(Geldanamycin, GDM)和由本实验室合成的格尔德霉素衍生物CNDG。一、力达霉素对卵巢癌细胞的影响MTT检测表明,LDM (0.01nM、0.05nM、0.1nM、0.5nM和0.1nM)作用于SKOV-3细胞24小时后,可以呈剂量依赖性的抑制细胞增殖,细胞凋亡比率随浓度增加而升高。Western blot检测显示0.01nM的力达霉素可以增强HER2的磷酸化水平,而0.1和1 nM的力达霉素降低HER2的磷酸化。在体外模拟缺氧条件用CoC12处理细胞体外模拟肿瘤的缺氧状态,结果显示力达霉素可以明显的降低缺氧诱导因子HIF-1α的水平。二、Hsp90抑制剂可以增强力达霉素对卵巢癌SKOV-3、乳腺癌MCF-7、肺癌A-549、肝癌Bel-7402细胞的杀伤作用用MTT法检测力达霉素与格尔德霉素(GDM)联合应用对卵巢癌SKOV-3细胞增殖的影响,计算力达霉素(0.01nM、0.05nM)与格尔德霉素(10nM、50nM,100nM、500nM, 100nM)单药及联合后对卵巢癌SKOV-3细胞增殖的抑制作用,并通过公式计算其联合指数,力达霉素与格尔德霉素100nM、500nM联合作用有明显的联合抑制细胞增殖的作用。CNDG与力达霉素联合可显示与格尔德霉素相似的作用。实验表明力达霉素与Hsp90抑制剂联合应用可以明显增强抑制细胞增殖的水平。同样的实验条件,我们选择了三种其他种类的肿瘤细胞进行相应的实验,Hsp90抑制剂同样能够增强力达霉素对细胞的杀伤能力,伴随着诱导凋亡的增加、DNA损伤后修复的减少,G2／M期阻滞降低等现象,说明Hsp90抑制剂对力达霉素的增效作用是可以广泛适用于多种肿瘤细胞。三、Hsp90抑制剂增强力达霉素对SKOV-3细胞诱导凋亡的作用以不同浓度格尔德霉素预处理SKOV-3细胞16小时,力达霉素(0.01nM, 0.05 nM)作用于24 h后,PARP的切割水平在联合应用时大幅度升高；用Annexin V-PI双染检测凋亡细胞,其中0.05 nmol/L LDM作用于SKOV-3细胞凋亡率为14%,200nM格尔德霉素作用于SKOV-3细胞凋亡率为16.1%,两者联合后细胞的凋亡比例为32.2%,单独用药与联合用药相比P<0.01。联合指数0.89。四、Hsp90抑制剂增强力达霉素对卵巢癌SKOV-3细胞的DNA双链断裂作用力达霉素杀伤肿瘤最主要是通过切割DNA,导致DNA双链断裂。我们借助γH2AX水平来了解细胞内DNA双链断裂的程度,通过Western blot和免疫荧光实验可以看到,γH2AX在力达霉素和格尔德霉素联合应用的情况下细胞内的γH2AX明显增加,尤其是细胞核内的γH2AX水平,说明格尔德霉素的联合应用能够增强力达霉素的DNA断裂能力。五、Hsp90抑制剂增强力达霉素对卵巢癌SKOV-3细胞的杀伤作用是通过抑制力达霉素诱导的DNA损伤后修复实现的在用0.05 nM力达霉素处理细胞1小时后,细胞内的γH2AX大量增加,说明在此期间细胞内产生大量的DNA双链断裂,但6小时后yH2AX阳性细胞减少或细胞内γH2AX染色程度减弱,细胞内本来存在的双链断裂减少了；而用格尔德霉素预处理的细胞内的γH2AX没有发生大的变化,所以格尔德霉素的预处理可以抑制由力达霉素诱导的DNA损伤后修复。六、Hsp90抑制剂可以抑制力达霉素诱导的G2／M期阻滞不同剂量力达霉素处理SKOV-3细胞24 h,流式细胞仪检测细胞周期分布变化。结果显示,力达霉素诱导SKOV-3细胞发生G2／M期阻滞,该作用呈剂量相关。随着力达霉素浓度增加,G2／M期细胞比例逐渐增加。用不同剂量的格尔德霉素预处理细胞16小时,再用不同剂量的力达霉素处理细胞24小时,用流式细胞仪检测细胞周期分布。在SKOV-3细胞中,0.05 nM力达霉素处理细胞可以使G2／M期细胞从15.28%增加到76.79%,而经过200nM格尔德霉素预处理细胞G2／M期百分比大大下降,从76.79%下降到29.33%。说明格尔德霉素可以抑制力达霉素在SKOV-3细胞中诱导的G2／M期细胞周期阻滞。七、Hsp90抑制剂可以降低某些与基因组稳定性相关的蛋白或抑制其活性Western blot分析Hsp90抑制剂可以抑制多种与基因组稳定性相关的蛋白水平或抑制其活性,其中包括ATM、ATRIP、BRCA1、RPA70。其中,ATRIP的总蛋白水平的下降可以被蛋白酶体抑制剂MG132的作用所阻断。结论：本研究首次研究了Hsp90抑制剂对烯二炔类抗生素力达霉素的增敏效果。在卵巢癌SKOV-3细胞中Hsp90抑制剂能够通过抑制DNA损伤后修复增加力达霉素对DNA的断裂作用,从而增强力达霉素的细胞毒作用。同时在其他种类的细胞：人乳腺癌MCF-7、人肺癌A549和人肝癌Bel-7402中也可以看到相类似的作用。总之,Hsp90抑制剂可以降低细胞基因组稳定性,抑制力达霉素所诱导的DNA损伤后修复作用,增加力达霉素对细胞造成的DNA损伤,从而增强其抗肿瘤活性。