目的:流行病学调查显示绝经后非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）的发病率显著升高。逍遥散（Xiao Yao San,XYS）作为有疏肝功效的经典方,广泛用于治疗更年期各种症状。现代研究显示逍遥散具有类似雌激素的作用,可以改善脂代谢异常。然而,逍遥散对于女性绝经后NAFLD是否有改善作用还未见报道。因此本课题通过临床病历收集探索了绝经综合征不同中医证型NAFLD的分布;从整体和细胞水平探讨逍遥散对绝经后NAFLD的干预作用及其分子机制。方法:1.理论探讨:系统性的文献检索总结中医古籍及现代学者对于更年期综合征的病名、病因病机及治疗方法的认识。分析肾虚肝郁,痰瘀互结于肝是绝经后NAFLD的主要发病机理。疏肝法是绝经后NAFLD的重要治法,为XYS治疗绝经后肝脂肪变性提供理论依据。从现代医学角度讨论绝经与NAFLD的关系。2.临床资料研究:采用横断面研究方法进行研究。收集就诊于淮安市妇幼保健院更年期门诊、妇科门诊以及中医妇科门诊的符合纳入标准的绝经后绝经综合征患者200例,分析各影响因素、各证型之间的相关性;调查绝经综合征患者NAFLD的患病率以及中医证型分布规律,明确绝经后NAFLD的常见中医证型。3.动物实验研究:（1）XYS的制备以及测定白芍苷、芍药苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量,对逍遥散进行质量评价。（2）绝经后NAFLD小鼠模型的复制、分组及给药:将符合实验要求的ApoE-/-小鼠随机分为空白对照组、模型组、雌激素组、XYS高剂量组、XYS低剂量组,每组各10只。对照组给予假手术以正常饲料喂养。其余组麻醉后切除双侧卵巢,高脂饲料喂养12周。（3）XYS对绝经后NAFLD小鼠模型体重、血浆TG、ALT与NEFA的影响:检测各组小鼠体重、小鼠空腹血浆甘油三酯（TG）、谷丙转氨酶（ALT）和中性脂肪酸（NEFA）水平。（4）XYS对绝经后NAFLD模型肝脏重量、TG及肝脂肪变性的影响:检测各组小鼠肝脏重量、肝脏TG含量、通过HE及油红O染色测量脂质含量、在透射电镜下观察脂滴。（5）通过 RT-qPCR 分析 SREBP-1c、FAS、ACC1、SCD-1、LXRα、PPARα、CPT1、ACOX1的mRNA水平;Westernblot检测LXRα和SREBP-1c蛋白在肝脏的表达;对ERα进行免疫染色、通过Western blot检查ERα蛋白的表达。4.细胞实验研究:（1）逍遥散药物血清（XYS-Serum）的制备:将30只小鼠随机分为对照组、XYS-高剂量组、XYS-低剂量组,每组10只。按照不同分组给予药物。用药连续7天。末次给药前禁食12h,.在末次给药后1小时从眼眶采血,1500rp/min,离心10min,无菌环境下分离血清,56℃恒温水浴灭活,0.22 μm过滤器过滤。最终得到XYS-HSerum、XYS-LSerum以及空白对照血清。（2）L02细胞培养:将细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中培养（100 U/ml青霉素+100μg/ml链霉素）,温度37℃,5%CO2培养箱储存。细胞通过胰蛋白酶消化和传代。（3）建立肝脂肪变性细胞模型,分组与给药:取对数生长期L02细胞种于6孔板中,培养24h后分为5组,分别为:对照组、模型组、XYS-HSerum、XYS-LSerum及雌激素组。为了诱导脂肪变性,除对照组外,其余各组均将细胞暴露于1 mmol/L的FFA混合物中（oleate:palmitate=2:1）持续24小时,然后分别给药,并继续培养24小时。（4）细胞活性检验:分别用终浓度为10%的空白对照血清、XYS-HSerum、XYS-LSerum处理24小时,进行MTT试验以评估细胞的活性,以未处理的细胞作为对照。（5）XYS-Serum对L02细胞脂代谢相关基因mRNA与蛋白表达的影响:RT-qPCR分析LXRα的 mRNA 表达;Western blot 检测 LXRα的蛋白表达;RT-qPCR 分析 SREBP-1c的mRNA表达;通过免疫荧光染色对SREBP-1c的蛋白表达进行分析;RT-qPCR分析FAS、ACC1 和 SCD-1 的 mRNA 表达。（6）XYS-Serum对L02细胞ERα表达及其活性的影响:RT-qPCR分析ERα的mRNA表达;双荧光素酶报告分析检测ERα活性;免疫荧光染色分析ERα蛋白表达。（7）ERα信号通路介导XYS-Serum对L02细胞脂肪变性的抑制作用的研究:雌激素受体抑制剂（ICI 182,780）对XYS-Serum降低L02细胞脂质蓄积以及TG含量的影响;RT-qPCR 分析 ICI 182,780 是否逆转 XYS-Serum 对 LXRa 和 SREBP-1c 的 mRNA 水平的影响;RT-qPCR 分析 ICI 182,780 是否逆转 XYS-Serum 对 FAS、ACC1 和 SCD1 的mRNA表达。5.进行数据分析结果:1.一般资料比较:除MHT补充情况患者间差距不显著（p＞0.05）,其余因素在患者间具有差异性分布的特点（p＜0.01）2.绝经综合征患者的中医证型的分布情况为:分布具有差异性（p＜0.05）。肝肾阴虚证（32%）＞肾虚肝郁证（27.5%）＞心肾不交证（24.5%）＞肾阴阳两虚证（16%）。3.绝经综合征中医证型与一般因素的相关性分析:在病程、BMI、年龄段、学历层次、MHT补充情况、是否运动、是否合并有高血压或糖尿病等因素的中医证型分布具有差异性（p＜0.05或p＜0.01）;在K评分、绝经后分期、绝经方式、是否吸烟与饮酒等因素的中医证型分布差异并不显著（P＞0.05）4.绝经综合征中NAFLD的患病率:本次调查符合纳入标准的绝经综合征患者共有200例,其中符合NAFLD诊断标准的患者共26例（13%）。5.绝经后NAFLD影响因素相关性分析:除是否患有高血压情况患者间差距不显著（p＞0.05）,其余因素包括年龄、绝经后分期、BMI、绝经方式、是否MHT治疗、是否吸烟、是否饮酒、是否运动、是否患糖尿病在患者间具有差异性分布的特点（p＜0.05或 p＜0.01）6.绝经后NAFLD各证型的分布:绝经后NAFLD在4种不同证型的分布中具有显著性差异（P＜0.01）。肾虚肝郁型患NAFLD 比率明显高于其他证型。7.对XYS的质量控制与成分研究:采用高效液相色谱法（HPLC）对XYS提取物中白芍苷、芍药苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的色谱峰进行了鉴定和含量测定,含量分别为1.26 mg/g、2.58 mg/g、1.33 mg/g 和 1.08mg/g。8.XYS对绝经后NAFLD模型体重、血浆TG、ALT与NEFA的影响:XYS对Ovx/ApoE-/-小鼠的体重没有影响（P＞0.05）;模型组血浆中TG、ALT和NEFA的水平均呈显著性增加（P＜0.01）。然而,逍遥散治疗后可显著降低血浆中TG、ALT和NEFA水平,（P＜0.05 或 P＜0.01）。9.逍遥散对绝经后NAFLD模型肝脏重量、TG及肝脂肪变性的影响:与对照组相比,模型组中的肝脏重量、肝脏TG含量均显著增加（P＜0.01）,而与模型组比较,逍遥散高剂量组（13.0 g/kg）、逍遥散低剂量组（6.5 g/kg）和E2组中,肝脏重量、肝脏甘油三酯含量明显减低（P＜0.05或P＜0.01）;模型组小鼠肝脏脂肪变性的严重程度和脂质含量明显增加（P＜0.01）。XYS可以显著减少肝脏脂质积累,减轻肝细胞脂肪变性,并呈现剂量依赖性（P＜0.05）。10.逍遥散对绝经后NAFLD模型脂质代谢基因以及ERα表达的影响:模型组中TG合成相关基因（包括SREBP-1c及其下游基因FAS、ACC1、SCD-1）的肝脏mRNA表达明显增加（P＜0.01）,参与脂肪酸β氧化的基因（包括PPARα及其靶基因ACOX1和CPT1）mRNA水平明显降低（P＜0.05）。XYS治疗显著下调了肝脏TG合成相关基因的mRNA水平（P＜0.05或P＜0.01）,但对PPARα、ACOX1和CPT1的mRNA表达没有影响（P＞0.05）;模型组中LXRα和SREBP-1c的蛋白表达量显著增加（P＜0.01）,然而XYS可降低LXRα和SREBP-1c的蛋白水平（P＜0.01或P＜0.05）呈剂量依赖性。11.逍遥散上调绝经后NAFLD小鼠肝脏ERα的表达:免疫组化和Western印迹分析显示,模型组肝脏中的ERα蛋白水平明显降低（P＜0.01）,而XYS治疗明显抑制了绝经后NAFLD小鼠肝脏中ERα蛋白的下调水平（P＜0.01或P＜0.05）12.XYS-Serum对L02细胞脂肪变性与ALT活性的影响:通过MTT实验结果发现,XYS-HSerum、XYS-LSerum几乎没有细胞毒性。13.XYS-Serum对FFA诱导的L02细胞脂肪变性及ALT活性的影响:与对照组相比,FFA处理的模型组细胞表现出明显的脂质积聚（P＜0.01）,XYS-Serum组的脂滴数明显减少（P＜0.05）。同样,XYS-Serum组也显著降低了脂肪变性细胞中的TG含量和ALT活性（P＜0.05）。FFA组细胞内TG含量和ALT活性均显著高于对照组（P＜0.01）14.XYS-Serum对L02细胞脂代谢相关基因mRNA与蛋白表达的影响:FFA组LXRαmRNA和蛋白水平均显著升高（P＜0.01）,XYS-Serum显著降低LXRα表达（P＜0.05）。此外,XYS-Serum抑制SREBP-1c及其靶向基因（FAS,ACC1和SCD-1）的mRNA水平（P＜0.05）。免疫荧光分析发现SREBP-1c的蛋白表达在不同组的变化趋势与mRNA的表达一致。15.XYS-Serum对L02细胞ERα表达及其活性的影响:与对照组相比XYS-Serum明显增加了 ERαmRNA水平（P＜0.05）。同样,免疫荧光染色也表明,XYS-Serum显著地增加L02细胞中ERα蛋白表达。测定荧光素酶活性发现,XYS-Serum明显提高了 ERα荧光素酶的活性（P＜0.01）。16.ERα信号通路介导逍遥散含药血清对L02细胞脂肪变性的抑制作用的研究:雌激素受体抑制剂ICI182,780对L02细胞中ERα进行干扰后,通过油红O和尼罗红染色发现,与对照组相比,受到ICI 182,780干预的两组,出现了明显的脂质蓄积情况（P＜0.01）,并消除了 XYS-HSerum对L02细胞中FFA刺激的脂质积累的抑制作用。同样,XYS-HSerum对细胞内TG含量的抑制作用也被ICI 182,780部分地消除了;XYS-HSerum结合ICI182,780处理则明显降低了 ER荧光素酶的活性（P＜0.01）;ICI 182,780部分逆转了 XYS-HSerum对FFA刺激的L02细胞中LXRa、SREBP-1c及其靶基因的mRNA水平的抑制作用。结论:肾虚肝郁证为绝经后NAFLD的常见中医证型。逍遥散对绝经后NAFLD小鼠模型以及经FFA诱导的L02细胞肝脂肪变性模型都具有抑制肝脂肪变性的作用。其机制可能为通过调节肝脏ERα抑制转录因子SREBP-1c表达,进而抑制SREBP-1c其下游肝内脂质代谢因子（FAS、ACC1、SCD-1）表达有关。因此,XYS可以用于预防绝经后妇女NAFLD相关的脂代谢疾病。