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目的:本研究通过网络药理学方法结合基于体内、体外肝纤维化（Hepatic fibrosis,HF）模型开展的实验验证来共同探究一贯煎调控肝星状细胞（Hepatic stellate cells,HSCs）阻逆肝纤维化的分子机制,为临床运用中医药治疗肝纤维化提供科学依据。方法:1.网络药理学分析一贯煎治疗肝纤维化潜在通路靶点在TCMSP和BATMAN-TCM、Swiss ADME数据库获取并筛选一贯煎方中每味药物的主要活性成分,利用Swiss Target Prediction数据库根据化合物化学相似性预测靶点,在Gene Cards和Dis Ge NET数据库筛选肝纤维化疾病靶点,绘制韦恩图得到一贯煎和肝纤维化的共有靶点,并通过Uniprot数据库校正。再经String数据库构建PPI蛋白相互作用网络,将其导入Cytoscape软件中进行网络拓扑学分析,得到潜在靶点。最后利用DAVID数据库分析潜在靶点的GO功能、KEGG通路富集水平,于Cytoscape软件中绘制“活性成分-核心靶标-信号通路”可视化网络图,分析确定一贯煎治疗肝纤维化的关键靶点和通路。2.体内实验探究一贯煎治疗肝纤维化大鼠的分子机制90只SD雄性大鼠适应性喂养7天后,随机分成正常组和模型组。按1∶1比例配制CCl4橄榄油溶液,模型组大鼠每2周按照2 ml/kg、1 ml/kg、0.5 ml/kg的剂量依次递减进行腹腔注射,每周2次,正常组用等容量的橄榄油代替CCl4溶液。连续注射6周后,每组随机抽取3只大鼠切除肝脏,通过HE染色及Masson染色检测大鼠肝组织病理形态,判定肝纤维化模型建立情况。其余模型组大鼠分为模型组、阳性药组、一贯煎低、中、高剂量组,从第7周开始,停止腹腔注射,阳性药组灌胃秋水仙碱混悬液0.25 mg/kg（相当于成人用量30倍）,一贯煎高、中、低剂量治疗组分别予以一贯煎药液剂量10 g/kg、5 g/kg、2.5 g/kg,体积为10 ml/kg·d,其余两组给予相同量生理盐水,持续4周。第10周末所有大鼠用戊巴比妥钠溶液按30 mg/kg剂量腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,切除肝脏组织。Masson染色和HE染色观察肝组织病理变化,ELISA检测AST、ALT,LN、HA、HYP等生化指标,Western blot检测肝星状细胞活化相关蛋白α-SMA、COL-Ⅰ的表达情况,以及验证网络药理学筛选出的有关通路蛋白。3.体外实验研究一贯煎对活化的大鼠HSC-T6细胞的分子机制采用TGF-β1作为诱导剂,刺激HSC-T6细胞,以构建体外肝纤维化模型,制备大鼠一贯煎含药血清。采用MTS法检测一贯煎对HSC-T6细胞增殖的影响,流式细胞术检测一贯煎对HSC-T6细胞周期、凋亡的影响,Western blot实验检测一贯煎对HSC-T6细胞活化分泌相关蛋白α-SMA、COL-Ⅰ的表达影响以及验证网络药理学筛选出的关键通路靶点。结果:1.网络药理学方法共收集到一贯煎治疗肝纤维化147个主要活性成分,891个主要靶标,3301个肝纤维化疾病靶点,两者的交集靶点共470个推测为一贯煎治疗肝纤维化的潜在靶点。对潜在靶点构建PPI网络筛选出42个核心靶点,GO功能、KEGG通路富集分析获得473条GO富集分析条目、106条信号通路,GO功能富集分析结果提示一贯煎在胞浆、细胞核、细胞质、线粒体等细胞组分上通过调控细胞增殖、凋亡、一氧化氮生物合成、蛋白质磷酸化等生物过程,影响酶结合、蛋白质结合、激酶活性、受体结合等分子功能,从而治疗肝纤维化。从“核心靶点-通路”网络图分析推测,一贯煎通过PI3K-Akt、MAPK信号通路等发挥抗肝纤维化作用,AKT1、TNF、ALB、EGFR、β-Catenin、SRC、VEGF、IL-1β、MAPK3、STAT3等可能为关键作用靶点。选择其中Degree值靠前的PI3K/Akt信号通路进行下一步实验验证。2.CCl4造模6周模型组大鼠体质量增加低于正常组,大鼠肝组织病理结果显示模型组部分肝小叶结构紊乱,汇管区有轻度或中度炎症现象,汇管区扩大伴有胶原纤维增生增厚,提示肝纤维化模型造模成功。一贯煎治疗4周后,肝组织HE染色和Masson染色显示模型组大鼠出现炎性细胞浸润,肝细胞水肿现象并伴随肝细胞水样变性坏死,汇管区周围可见胶原纤维增生增厚现象,一贯煎低、中、高剂量组肝细胞水肿及坏死程度减轻,有少量胶原纤维沉积,炎性细胞浸润减少,纤维化程度与模型组相比明显减轻。ELISA结果显示,与模型组相比,一贯煎低、中、高剂量组大鼠ALT、AST、Hyp、LN、HA水平降低。WB结果显示与正常组相比,模型组大鼠肝组织中α-SMA、COL-Ⅰ、p-PI3K、p-Akt表达量均明显升高,与模型组比较,一贯煎各剂量组α-SMA、COL-Ⅰ、p-PI3K、p-Akt表达均降低。3.筛选最佳浓度为8 ng/mL的TGF-β1活化HSC-T6细胞,构建体外肝纤维化模型,MTS结果显示48h内一贯煎低、中、高剂量组抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞增殖。流式细胞术结果提示一贯煎低、中、高剂量组HSC-T6细胞的凋亡率明显升高,G0/G1期细胞比例上升,S期细胞比例减少,Western blot结果显示与空白血清组比较,一贯煎低、中、高剂量组α-SMA、COL-I、p-PI3K、p-Akt蛋白的表达均有下调趋势。结论:一贯煎中多种药物活性成分具有抗氧化应激、抗炎等作用,可通过多途径、多靶点调控肝纤维化进程。一贯煎可减轻CCl4诱导的大鼠肝纤维化程度,显著改善大鼠肝损伤,可阻滞HSC-T6周期于G0/G1期,抑制其活化、增殖,促进凋亡,降低细胞外基质成分沉积等途径抗肝纤维化,其机制与抑制PI3K-Akt信号通路传导有关。