目的:近年来,越来越多的研究表明,长链非编码RNA（lncRNA）与各种肿瘤的发生、发展和治疗密切相关,并在这些过程中发挥着关键作用。EGFR-AS1,作为编码基因EGFR的反义lncRNA（AS-lncRNA）,在乳腺癌中的功能作用和潜在调节机制尚不清楚。首先EGFR-AS1在TCGA和Star Base数据库、乳腺癌组织和细胞系中呈高表达。FISH和核质分离实验均证实EGFR-AS1主要位于乳腺癌细胞的细胞质中,具有转录后调控潜力。通过Western blot实验检测迁移和侵袭相关蛋白（ROCK1、Rho A、MMP2、Rho B）和上皮-间质转化（EMT）相关蛋白（N-cadherin,Slug,Snail,和Vinmentin）,并结合体外细胞功能学实验如MTT、克隆形成试验、EDU和Transwell及裸鼠成瘤实验,均证实了EGFR-AS1在体内外均可充当乳腺癌促癌因子发挥作用。GESA富集分析表明EGFR-AS1激活PI3K/AKT通路并可能参与药物敏感性调节。EGFR-AS1可以作为化疗耐药的重要调节因子,敲低EGFR-AS1后确实增加了乳腺癌细胞对多西他赛的敏感性。机制上,EGFR-AS1可以作为microRNAs的分子海绵参与“ceRNAs”的调控,通过Star Base、mi RBase、RegRNA2.0等生物信息学软件对EGFR-AS1所结合的mircoRNA及下游基因进行预测。经双荧光素酶报告基因实验、Pull-down、real-time PCR、并辅以western blot及功能学共转染恢复实验,首次提出EGFR-AS1/mi R-149-5p/ELP5轴进而促进乳腺癌细胞生物学行为的结论。进一步探究其作用机制发现,ELP5也可以激活PI3K/AKT通路,并加入LY294002验证激活通路的正确性,EGFR作为PI3K/AKT通路经典上游分子,探究ELP5与EGFR的关系。Co-ip实验证实ELP5可以与EGFR结合进而介导PI3K/AKT通路进而诱导乳腺癌细胞上皮-间质转化,从而促进其增殖,乳腺癌细胞在体内外的迁移和侵袭。由于EGFR-AS1与EGFR具有序列互补性,RIP实验证实EGFR-AS1也可以与EGFR进行顺式调控。在此过程中,ELP5对于EGFR-AS1对EGFR的调控作用必不可少。研究方法:1、临床标本2005年至2014年在中国医科大学附属第一医院接受手术的33对乳腺癌原发肿瘤标本,术后进行乳腺癌组织及其配对癌旁组织福尔马林固定后,分别对癌组织对提取总蛋白及总RNA,然后进行western blot测定EGFR及ELP5指标的蛋白水平的相对表达量。Real-time PCR分析测定EGFR-AS1、mi R-149-5p、EGFR及ELP5 mRNA水平的相对表达量。应用SPSS16.0软件配对t检验分析乳腺癌组织与配对癌旁组织各指标是否具有差异表达性。应用Pearson卡方检验分析各指标之间是否具有相关性。其中有15名可获得组化切片的随访数据,乳腺癌组织芯片中16例正常组织78例乳腺癌组织。2、细胞培养人正常乳腺细胞系MCF-10A细胞在1:1 Dulbecco’s改良Eagle’s培养基（DMEM）/F12（Gibco,Waltham,MA,USA）中培养,添加5%胎牛血清、10μg/m L胰岛素（Sigma-Aldrich Co,St.Louis,MO,USA）和20 ng/m L表皮生长因子（EGF）。MCF-7和SK-BR-3细胞系在补充有10%FBS的DMEM（Gibco）中培养。MDA-MB-231细胞在补充有10%胎牛血清（FBS）的L15（Gibco）中培养。BT549细胞在Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640（Gibco）中培养,并添加10%FBS。细胞在37°C下在含有5%CO2的潮湿环境中培养。3、细胞转染与干扰将人乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231均匀接种在六孔板中,并将细胞在37°C下在含有5%CO2的潮湿环境中培养过夜。LncRNA EGFR-AS1 siRNA、si ELP5、mi R-149-5p模拟物MIMICS和抑制物Inhibitors购自广州睿博生物科技有限公司。质粒p CMV6-ddk-myc和p CMV6-ddk-myc-ELP5购自Origene（Rockville,MD,USA）。使用Lipofectamine3000试剂（Invitrogen）按照厂家说明进行转染,培养24-48小时后进行细胞收取。4、稳定转染细胞筛选EGFR-AS1-shRNA质粒购自吉玛基因公司（嘌呤霉素耐药）。将MCF-7细胞种于24孔板中,加入不同梯度的嘌呤霉素（1-11μg/ml）用以确定细胞最佳耐受浓度。48小时后加入含嘌呤霉素的培养液（本嘌呤霉素为6μg/ml）,每1-2天更换培养液。经4周左右,获取稳定表达目的基因的细胞系。5、Real-time PCR使用TRIzol从乳腺癌组织和细胞中提取总RNA,然后将部分RNA用于逆转录成c DNA（Ta Ka Ra,RR036A,Japan）。lncRNA的表达和基因转录水平通过SYBR-Green q PCR（Takara,Otsu,Shiga,Japan）（Step One Plus;Applied Biosystems,USA）测量。miRNA水平由（Takara,047A Shiga,Japan）测定。并应用Applied Biosystems 7500仪器（Applied Biosystems,Foster City,CA）进行mRNA水平表达量的测定。2-ΔΔCT方法用于量化基因表达。6、Western blot检测使用裂解缓冲液（Thermo Fisher Scientific）对乳腺癌组织及细胞样的总蛋白质进行提取,考马斯亮蓝测蛋白质浓度并配置样品后,100℃沸水煮样使其变性。上样80μg/18μl的总蛋白质样品通过10%SDS-PAGE分离,然后转移到PVDF膜上（Millipore,Billerica,MA,USA）。用TTBS缓冲液配制的5%BSA封闭2小时后,将膜在4°C下与1%BSA配制的一抗孵育过夜16小时,然后37°C下在恒温摇床上以辣根过氧化物酶标记孵育2小时。最后,用TTBS缓冲液洗涤后,在生物成像系统（Biolenged,USA）上使用ECL发光液进行可视化。使用Image J软件分析蛋白质水平表达的灰度值。7、细胞增殖能力检测将乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231均匀接种在六孔板中,培养过夜进行转染或干扰的各指标表达,24小时左右进行细胞数量测定。计数后再分别均匀铺在无菌的96孔板及6孔板中,而后进行MTT、克隆形成实验及EDU的检测。8、细胞迁移和侵袭能力检测将乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231均匀接种在六孔板中,培养过夜进行转染或干扰的各指标表达,24小时左右进行细胞数量测定。计数后在24孔板中加入600μl 10%浓度的相应培养基后放入transwell小室,上室中实验组与对照组保证加入等数量细胞200μl 2%浓度培养基体系中,使细胞悬液吹匀吹打后加入上室,形成浓度梯度差检测细胞迁移和侵袭能力。24小时左右拿出24孔板进行清洗、固定、棉签擦拭上室表面细胞并进行正置荧光显微镜拍照测定穿过小室的细胞数量。9、核浆分离实验将乳腺癌细胞使用PARISTM试剂盒（Ambion,AM1921）进行细胞核和细胞质RNA的分离并进行real-time PCR测定。U6,β-actin用作细胞质对照和核对照。10、RNA下拉测定制作EGFR-AS1及mi R-149-5p的特异性探针,将乳腺癌细胞裂解后与3μg纯化的生物素化转录物在25°C下孵育1小时;链霉亲和素琼脂糖珠（Invitrogen,Karlsruhe）用于分离复合物。使用苯酚:氯仿:异戊醇（125:24:1 p H=4.3）纯化下拉材料中存在的RNA,并通过real-time PCR分析进行检测。11、双荧光素酶报告基因实验使用Dual Luciferase Reporter System Kit（E1910,Promega,USA）构建野生型或mut-lnc EGFR-AS1荧光质粒、和野生型或mut-ELP5 3’-UTR片段荧光质粒。然后,我们使用Lipofectamine 3000（Invitrogen Co,Carlsbad,CA,USA）将mi R-149-5p模拟物与报告基因荧光质粒、海肾荧光素酶（TK）分别共转染48小时到乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞中。以海肾荧光素酶为对照,利用酶标仪测定海肾荧光素酶及荧光质粒的活性。12、RNA荧光原位杂交EGFR-AS1 FISH探针设计并合成后,将乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次,并在4%甲醛中固定15分钟。固定的细胞用Triton X-100进行细胞膜打孔处理,并通过浓度梯度递增的乙醇进行脱水。然后将细胞与50 nmol探针在杂交缓冲液中,而后在73°C下孵育5分钟。细胞在37°C下杂交14小时,洗涤并脱水。添加DAPI工作溶液后,共聚焦显微镜对细胞进行扫描和成像。13、免疫组织化学染色4μm厚的乳腺癌组织切片用二甲苯连续脱蜡,10%中性福尔马林固定,石蜡包埋。使用标准链霉亲和素-过氧化物酶复合物方法进行免疫组织化学染色。然后将组织切片与ELP5抗体（1:300;Origene,剑桥,英国）在4°C下孵育过夜,洗涤后,然后使用生物素化山羊抗兔Ig G二抗,用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素显色试剂,然后用3,3’-二氨基联苯胺（DAB）染色3-5分钟。细胞核用苏木精复染。根据整个组织切片内的阳性细胞百分比（PP）和染色强度（SI）估计ELP5表达水平。14、免疫共沉淀将乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞加入NP40蛋白裂解液裂解细胞,12000r/20mins离心后,抽取上清的蛋白裂解液。加入磁珠后经两个小时的封闭作用后离心抽取上清,加入ELP5抗体,4°C摇床过夜后加入磁珠再摇6-8小时。结束后经1000r/5mins离心,留磁珠并加入loading煮样使样品变性,而后进行Western Blot实验并孵育EGFR抗体。检测ELP5与EGFR是否存在结合作用。15、半衰期检测将乳腺癌细胞均匀铺在无菌6孔板中对EGFR-AS1进行干扰并设置5个副孔,分别在0,2,4,8,12小时后加入放线菌素D,并收取细胞提取RNA进行real-time PCR测定其EGFR mRNA水平的稳定性。16、RNA免疫共沉淀将乳腺癌细胞裂解后与抗EGFR Ig G在4°C摇床孵育12小时。使免疫复合物与30μl Protein A/G珠子结合。3-6小时后,洗涤珠子,然后直接重悬在TRIzol试剂中并进行RNA分离。最后经合成特异性引物后,对免疫沉淀的RNA进行real-time PCR分析,以确认EGFR-AS1与EGFR相互作用的存在。同时,通过琼脂糖凝胶电泳解析并通过银染显色。17、裸鼠体内成瘤实验从自维通利华（中国北京）购买雌性BALB/C裸鼠（4周龄）10只,保存在SPF级无病原体动物实验室。当肿瘤细胞处于对数生长期时,细胞状态良好且分裂迅速,收集此时1×10~7/每只稳定转染的MCF-7细胞在裸鼠（每组各5只）的右侧皮下注射。从注射细胞的第四天后开始测量皮下肿瘤体积,计算公式如下:每3天0.5×长度×宽度~2。21天后,取出瘤体,测量瘤体体积并称重,并暂存在-80°C冰箱用于后续分析。18、数据库分析本研究应用TCGA、GESA、Star Base、mi RBase和RegRNA2.0等数据库软件得到乳腺癌组织内指标的表达及预后,及指标间结合位点分析。19、统计学分析统计软件SPSS 22.0（SPSS,Chicago,IL,USA）用于所有分析。配对t检验用于比较两组的显着差异。Sperson相关性分析用于确定各指标之间表达量的相关性。Mann-Whitney U检验用于蛋白质印迹结果和迁移及侵袭图像分析。P＜0.05被认为具有统计学意义,实验均重复三次。结果:1、TCGA、Star Base数据库及33对乳腺癌组织对real-time PCR结果显示:EGFR-AS1在乳腺癌组织中表达水平高于配对癌旁正常乳腺组织,在乳腺癌细胞系中表达水平高于正常乳腺上皮细胞MCF-10A。FISH及核浆分离实验结果测定lncRNA EGFR-AS1在乳腺癌细胞胞浆及胞核中均有分布,且大部分位于细胞浆。Western blot检测迁移侵袭相关蛋白（ROCK1,Rho A,MMP2,Rho B）上皮-间质转化（EMT）相关蛋白（N-cadherin,Slug,Snail,Vinmentin）的表达水平,应用细胞功能学实验如MTT增殖测定、集落形成实验、EDU、transwell等,实验结果显示:EGFR-AS1促进乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力并加快EMT进程。GESA通路富集分析结果显示与PI3K、AKT共表达,激活PI3K/AKT通路促进乳腺癌的发生发展,可参与调节乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性,并与乳腺癌不良预后相关。2、多种数据库根据序列分析得到能与EGFR-AS1结合的microRNA,经pull-down测定下拉结合作用及real-time PCR测定调控作用后选择mi R-149-5p作为研究的microRNA。双荧光素酶报告基因实验证明两者可以结合,33对乳腺癌组织对的real-time PCR结果经Person相关性分析后,结果显示EGFR-AS1与mi R-149-5p表达之间具有负向相关关系。Real-time PCR结果还显示EGFR-AS1与mi R-149-5p存在负向调控作用。在乳腺癌细胞中对si-EGFR-AS1与mi R-149-5p inhibitor进行分别转染及共转染后,通过Western blot实验及功能学挽救实验显示由si-EGFR-AS1诱导的ELP5、ROCK1、Rho A蛋白表达水平的降低和P21蛋白水平表达升高作用都被mi R-149-5p抑制物部分逆转,有所恢复。MTT增殖测定、集落形成实验、EDU及transwell测定结果揭示:由EGFR-AS1敲低介导乳腺癌细胞的的增殖、迁移和侵袭的减弱作用被mi R-149-5p抑制物部分逆转,有所恢复。3、多种数据库根据序列分析得到与mi R-149-5p结合的下游基因经real-time PCR筛选调控作用后选定指标ELP5为研究基因。双荧光素酶报告基因结果显示mi R-149-5p与ELP5相互结合。Real-time PCR和Western blot检测无论在蛋白水平还是mRNA水平上,mi R-149-5p对ELP5都有调控作用,并呈负性调控。Pearson相关分析结果显示:在乳腺癌组织中mi R-149-5p与ELP5 mRNA水平的表达也呈负向相关。在乳腺癌细胞中对si-ELP5与mi R-149-5p inhibitor进行分别转染及共转染后,通过Western blot及功能学挽救实验显示:由si-ELP5诱导的ELP5、ROCK1、Rho A蛋白表达水平的降低和P21蛋白水平表达升高作用都被mi R-149-5p抑制物部分逆转,有所恢复。MTT增殖测定、集落形成实验、Edu及transwell测定结果揭示由ELP5敲低介导乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力的减弱作用可被mi R-149-5p抑制物部分逆转,有所恢复。4、探究EGFR-AS1与ELP5之间的关系,对相关组织样本进行免疫组织化学染色结果显示:EGFR-AS1高表达的乳腺癌组织样本中ELP5也有较强染色,即相对强阳性的表达。EGFR-AS1低表达的乳腺癌组织样本中ELP5染色较弱,即相对弱阳性的表达。得出EGFR-AS1和ELP5mRNA水平之间具有表达的正相关性。再根据中位数分组法,将结果排列后分为ELP5低表达组（n=16）和ELP5高表达组（n=16）后,分别应用real-time PCR检测两组的EGFR-AS1水平,结果显示:ELP5高表达组EGFR-AS1的表达水平明显高于ELP5低表达组。Pearson相关分析显示乳腺癌组织中ELP5 mRNA水平的表达与EGFR-AS1表达呈正相关。Real-time PCR和Western blot结果显示EGFR-AS1敲低后均降低了ELP5mRNA水平和蛋白水平的表达。在乳腺癌细胞中对si-EGFR-AS1与ELP5过表达质粒进行分别转染及共转染后,通过Western blot及功能学挽救实验显示通过挽救实验进一步印证调控作用,Western blot检测ELP5、N-cadherin、Vinmentin、PI3K、P-AKT和AKT在蛋白水平表达,实验结果显示:共转染组相对于单EGFR-AS1敲减组对ELP5、N-cadherin、Vinmentin、PI3K、P-AKT在蛋白水平表达的减弱作用有所逆转部分恢复。证实了EGFR-AS1-mi R-149-5p-ELP5调控轴通过激活PI3K/AKT通路进而促进乳腺癌进展。5、在乳腺癌细胞中加入浓度梯度的多西他赛后,应用MTT检测多西他赛在MCF-7和MDA-MB-231细胞中的IC50值,分别为5.05n M,2.36n M。Real-time PCR和Western blot结果测定细胞中加入IC50浓度的多西他赛及1/2IC50浓度的多西他赛,并评估EGFR-AS1、mi R-149-5p和ELP5的水平。Real-time PCR和Western blot结果显示EGFR-AS1的表达水平随着药物浓度的增加而增加,实验结果证明在乳腺癌细胞中EGFR-AS1的增加具有多西他赛依赖性,且EGFR-AS1/mi R-149-5p/ELP5轴参与了对多西他赛敏感性的调控。在敲低EGFR-AS1后,MCF-7和MDA-MB-231细胞的IC50值降低。集落形成和MTT增殖试验证明在加入IC50浓度值的多西他赛后,EGFR-AS1表达较低的细胞具有较差的细胞活力。进一步证实了敲低EGFR-AS1后可以促进乳腺癌细胞对多西他赛的敏感性。6、裸鼠体内成瘤实验证明EGFR-AS1敲低组与比对照组相比形成了明显更小的肿瘤,其中肿瘤生长曲线,肿瘤体积和肿瘤重量也明显受到抑制。应用real-time PCR和western blot分析瘤体后结果显示EGFR-AS1敲减作用明显且对mi R-149-5p和ELP5具有调控作用。ELP5、EMT相关蛋白（N-cadherin,Vinmentin,Slug,Snail）和PI3K/AKT通路相关标志物的蛋白水平的表达也有抑制作用。体内实验与体外细胞实验结果一致,EGFR-AS1可作为乳腺癌的促癌因子,促进乳腺癌细胞的生长和转移。7、利用TCGA、Star Bas等数据库及33对乳腺癌组织对real-time PCR结果和Western blot结果对ELP5进行相对表达量的分析,结果显示:无论在蛋白水平及mRNA水平,ELP5在乳腺癌组织中的表达水平高于配对癌旁正常乳腺组织,在乳腺癌细胞系中的表达也高于正常乳腺上皮MCF-10A。16例正常乳腺组织及78例乳腺癌组织经免疫组织化学染色后结果显示:ELP5在正常乳腺组织中成阴性或弱阳性表达,而在乳腺癌组织中呈弱阳性或强阳性表达。Real-time PCR及Western blot结果显示ELP5可以正向调控EGFR的表达。Co-IP实验结果显示ELP5可与EGFR相结合,即可通过EGFR介导激活PI3K/AKT通路,进而影响乳腺癌的发生发展。8、探究ELP5、EGFR-AS1与EGFR之间的关系,数据库结果显示EGFR-AS1与EGFR有结构互补性且蛋白水平及mRNA水平的表达都具有正相关性。Real-time PCR结果及Western blot结果且可在转录水平及翻译水平影响EGFR的表达。加入放线菌素D检测EGFR mRNA水平的稳定性,结果显示:在敲低EGFR-AS1表达后EGFR mRNA水平稳定性也减弱,且在4h时表达显著降低。RIP结果显示EGFR-AS1与EGFR能够相互作用并调控其表达。进行同时过表达EGFR-AS1和敲低ELP5的共转染实验,Western blot检测EGFR蛋白水平的表达,结果显示共转染组相对于EGFR-AS1过表达组,EGFR的表达有所降低。说明ELP5对于EGFR-AS1对EGFR的调控作用是必须的。结论:1、EGFR-AS1促进乳腺癌细胞的增殖,迁移,侵袭及EMT进程并激活PI3K/AKT通路2、EGFR-AS1-mi R-149-5p-ELP5/PI3K/AKT轴促进乳腺癌进展3、敲低EGFR-AS1可促进乳腺癌细胞对多西他赛的敏感性4、EGFR-AS1在体内可作为乳腺癌促癌因子发挥作用5、ELP5通过介导EGFR激活PI3K/AKT通路进而促进乳腺癌细胞增殖,迁移,侵袭能力及EMT进程6、EGFR-AS1对EGFR的调控作用依赖ELP5的参与