【摘 要】
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非洲马瘟（African horse sickness,AHS）是由非洲马瘟病毒（African horse sickness virus,AHSV）引起的一种感染马、驴、骡等马属动物的传染病。该病的主要特征为发热和肺水肿,病死率极高,幼龄马匹可达到95%,是严重危害世界养马业的重大疫病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定必须报告的疫病,在我国被列为一类动物传染病。非洲马瘟主要分布在撒哈拉沙漠
【基金项目】
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国家重点研发计划项目（2021YFD1800502和2017YFD0502300）； 国家自然科学基金项目（31672562）；
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非洲马瘟（African horse sickness,AHS）是由非洲马瘟病毒（African horse sickness virus,AHSV）引起的一种感染马、驴、骡等马属动物的传染病。该病的主要特征为发热和肺水肿,病死率极高,幼龄马匹可达到95%,是严重危害世界养马业的重大疫病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定必须报告的疫病,在我国被列为一类动物传染病。非洲马瘟主要分布在撒哈拉沙漠以南的非洲地区,目前在我国尚未发现此病,但与我国邻近的泰国和马来西亚在2020年的3月与8月分别暴发了非洲马瘟疫情,一旦非洲马瘟传入我国,将对我国养马业造成巨大损失。非洲马瘟病毒的VP5和VP2结构蛋白互作形成了病毒的外层衣壳,是诱导机体产生中和抗体是主要蛋白抗原,其中VP2蛋白是AHSV最主要的血清型特异性抗原。本研究首先参考Gen Bank中的AHSV-1参考毒株序列,分别合成了S2（编码VP2）和S6（编码VP5）全长基因,长度分别为3218bp和1564bp。设计表达引物,通过PCR扩增、胶回收纯化后进行酶切,将S6基因亚克隆于杆状病毒穿梭载体p Fast Bac HTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了含有S6基因的重组穿梭质粒p Fast Bac HTB-AHSV-VP5。将该质粒转化DH10Bac感受态细胞,并经蓝白斑筛选后,进行PCR鉴定,获取阳性单克隆菌株,提取纯化转座杆粒Bacmid-AHSV-VP5,转染sf9昆虫细胞,获得表达AHSV-1 VP5蛋白的重组杆状病毒,SDS-PAGE和Western-blot结果显示,重组表达的VP5蛋白大小为60k Da,并利用镍柱层析获得了纯化的重组VP5蛋白。通过生物信息学软件对AHSV-1 VP2蛋白进行抗原性分析,将其分为1-502aa和503-1056aa进行原核表达,设计表达引物,以合成的S2基因为模板,进行PCR扩增,获得S2（1-502aa）和S2（503-1056aa）两段截短基因,分别与载体p RSF-Duet1-SUMO连接,获得了重组质粒p RSF-S2-502和p RSF-S2-1056,将其分别转化BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导表达,获得了大小分别为70k Da和72k Da的截短表达蛋白,通过镍柱层析分别获得了纯化的目的蛋白,并分别利用SUMO蛋白酶切掉了目的蛋白上的SUMO标签。将纯化的重组VP5、VP2（1-502aa）和VP2（503-1056aa）分别三次免疫新西兰大白兔,制备了特异性多克隆抗体,利用纯化的VP2截短蛋白VP2（1-502aa）和VP2（503-1056aa）进行了Dot-ELISA检测,结果显示制备的VP2截短蛋白特异性良好。本研究利用杆状病毒和大肠杆菌成功表达了AHSV-1 VP5和截短的VP2（1-502aa）和VP2（503-1056aa）结构蛋白并制备了相应的多克隆抗体,这为进一步研制AHSV的亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗提供了实验材料,同时也为建立基于VP2型特异性抗原的ELISA以及胶体金试纸条检测方法奠定了基础,对我国有效防控非洲马瘟的传入具有重要意义。
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