刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性胞内寄生虫,可导致免疫缺陷患者患病。弓形虫在中间宿主中有两种形式存在,分别是急性感染期的速殖子和慢性感染的缓殖子。在免疫缺陷宿主中,弓形虫的潜伏感染可从组织包囊中重新激活。包囊内存在大量支链淀粉,确保弓形虫在缺乏营养物质的情况下维持其生存。在支链淀粉代谢过程中,有许多淀粉代谢酶参与。其中,4-α-葡聚糖转移酶（4-alpha-glucanotransferase,4aGT）和淀粉-α-葡糖苷酶（Amylo-alpha-1,6-glucosidase,Aa16GL）在分解代谢过程,糖基转移酶家族8蛋白（glycosyl transferase family 8 protein,GT8）在合成代谢过程分别起到重要作用。在本研究中,利用CRISPR-Cas9介导的同源重组技术在4aGT、Aa16GL和GT8基因末端插入3×HA的标签蛋白基因,通过内源性启动子表达该蛋白。在间接免疫荧光试验（IFA）中观察三个蛋白在速殖子中的亚细胞定位。结果发现,Aa16GL定位于弓形虫细胞质中并以弥散型方式表达,而4aGT和GT8在IFA中没有观察到定位的荧光。为此,我们构建了重组质粒p ET30a-4aGT和p ET30a-GT8,转化至BL21感受态细胞中,通过ITPG诱导后进行原核表达。在SDS-PAGE电泳结果图中显示4aGT蛋白大小约为70 KDa,GT8蛋白大小为43.2 KDa,都与预期蛋白大小一致。超声破碎后蛋白电泳结果显示4aGT和GT8蛋白都以包涵体形式表达。通过免疫家兔获得这两个蛋白的多克隆抗体,后通过IFA对这两个蛋白进行定位,也未能观察到定位的荧光。利用CRISPR-Cas9介导的同源重组技术,构建了弓形虫I型RH株和II型PRU株的4aGT、Aa16GL和GT8基因敲除株。通过速殖子逸出、噬斑、胞内增殖、小鼠毒力试验、缓殖子转化率及小鼠脑包囊试验研究三个基因在弓形虫中的基本生物学特性。结果显示,分别敲除4aGT和GT8基因对弓形虫速殖子逸出、噬斑试验、胞内增殖、小鼠毒力试验、缓殖子转化率及小鼠脑包囊试验都没有影响。敲除Aa16GL基因对速殖子逸出、胞内增殖、缓殖子转化率及小鼠毒力试验没有影响,但Aa16GL基因的敲除使得噬斑变小,数量减少,出现轻微的生长缺陷。在慢性感染试验中,小鼠体内脑包囊的数量明显减少。由于钙离子依赖蛋白激酶（CDPK2）和糖原磷酸化酶（GP）的缺失可导致弓形虫体内支链淀粉异常积累,4aGT、Aa16GL和GT8作为支链淀粉代谢酶,Aa16GL可被CDPK2磷酸化。因此,我们通过透射电镜试验观察PRU虫株的4aGT、Aa16GL和GT8基因敲除株是否影响弓形虫速殖子期支链淀粉的代谢。结果发现,弓形虫4aGT、Aa16GL和GT8基因缺失并没有导致速殖子中支链淀粉异常积累,但是否会影响弓形虫其它周期阶段的葡萄糖通量和支链淀粉的积累还有待进一步研究。综上所述,本试验成功构建了弓形虫4aGT、Aa16GL和GT8蛋白定位株、弓形虫RH株和PRU株的4aGT、Aa16GL和GT8基因敲除株,阐明了4aGT、Aa16GL和GT8的基本生物学特性,发现Aa16GL基因的缺失致使弓形虫噬斑变小,数量减少,小鼠脑包囊数量减少。这些研究结果不仅为进一步深入研究弓形虫支链淀粉代谢酶的其它生物学功能奠定了基础,也为研究有效的抗弓形虫病药物或疫苗奠定了基础。