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多潜能干细胞(pluripotent stem cells)是指能够自我更新并具有分化成多种细胞潜能的细胞,它在细胞替代治疗、基因治疗、发育生物学等研究中具有独特的作用及优越性。目前,最为人类所熟知的多潜能性干细胞是胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞),它一般是从囊胚的内细胞团经过适当的培养而产生,也可通过体细胞核转移或细胞融合等途径得到多潜能性干细胞。然而胚胎干细胞的研究,尤其是人胚胎干细胞,都需要破坏胚胎或卵细胞,引发诸多伦理争议,应用于临床时还将面临免疫排斥等问题。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS细胞)的出现为解决上述难题提供了希望。与ESCs相比,iPS细胞有其独到的优势：①iPS由体细胞诱导产生,不存在ESCs面临的伦理问题；②iPS细胞来源广泛,iPS可来自患者体细胞(包括病变体细胞),经过克隆增殖分化可满足临床移植治疗数量上的要求；③来自患者的iPS避免了一直困扰再生医学界的免疫排斥难题。因此自iPS技术诞生以来,其在诱导效率、安全性及临床应用等相关研究中取得了巨大的进展。本研究利用逆转录病毒介导的方法将三个干细胞因子Oct4、Sox2、Klf4导入小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs),成功获得了小鼠iPS细胞,并对其干细胞标记的表达及全能性进行了分析鉴定。目的：1.利用Yamanaka三因子(Oct4、Sox2、Klf4)构建小鼠诱导性多能干细胞系。2.对所获得的iPS细胞进行鉴定及全能性分析,以期获得与胚胎干细胞类似的多能干细胞,为本课题后续将iPS细胞进一步定向分化为胰岛样细胞提供实验基础和技术平台。方法：1.逆转录病毒的制备：包含Oct4,Sox2和K1f4三个基因的逆转录病毒质粒pMXs-Oct3、pMXs-Sox2、pMXs-Klf4及参照质粒pMXs-EGFP由Addgene公司购买,使用DH5α细菌进行扩增后将4个质粒分别转染至逆转录病毒包装细胞Plat-E,48h后收集病毒上清,过滤、浓缩后用于感染MEFs。2.鼠胚成纤维细胞的分离与培养：无菌分离孕13.5d的BALB/C鼠胚,消化后接种至平皿培养。1-3代内的细胞用于iPS细胞的诱导。3.逆转录病毒感染MEF及iPS细胞的产生：将收集的病毒上清感染生长良好的MEFs,约1周时可首次看到iPS克隆,20d左右iPS克隆可长至做够大被挑取扩大培养。4.iPS细胞的生物学特性鉴定：通过镜下观察、碱性磷酸酶染色、反转录PCR(RT-PCR)、免疫荧光实验及畸胎瘤形成实验等对iPS细胞形态、多能性基因表达情况、干细胞表面标记及全能性等进行鉴定分析。结果：1.逆转录病毒的制备：逆转录病毒质粒转染Plat-E细胞48h后,荧光显微镜下可见绿色荧光表达(pMXs-EGFP),转染效率约在50-70%之间,细胞状态良好。2.鼠胚成纤维细胞的分离与培养：MEFs原代培养在接种后3-4h贴壁,细胞呈长梭形、多边形或不规则形,中间1-2个圆形或卵圆形的核,原代MEF杂细胞较多,随着传代次数的增多,其纯度增高,一般第二代后即可得到较纯的细胞。3.逆转录病毒感染MEFs及iPS细胞的产生：包含三个干细胞基因的逆转录病毒感染MEFs后大约一周左右可以在镜下首次看到iPS克隆,而后克隆继续增殖,12d左右形成肉眼可见的iPS集落,16-20d时克隆长至足够大,此时进行挑取、消化、接种至饲细胞上传代培养。4.iPS细胞的生物学特性鉴定：从MEFs获得的iPSCs镜下观察呈典型的克隆状生长,圆形或椭圆形,与饲细胞分界清楚；RT-PCR、碱性磷酸酶染色及免疫荧光检测iPS细胞高表达胚胎干细胞相关基因及蛋白；种植在免疫缺陷鼠体内能够形成向内中外三个胚层分化的畸胎瘤,表明iPSCs具有多潜能性。未感染逆转录病毒的MEFs不具有上述ES相关的细胞特性。结论：1.通过转导三个重编程因子(Oct4、Sox2、Klf4)可以将小鼠胚胎成纤维细胞诱导为多能干细胞,即iPS细胞。2.该iPS细胞具有ES样的生物学特性,并能长期多次传代而维持,表明初步建立了小鼠iPS细胞系。