肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，已成为全世界恶性肿瘤致死的主要原因。目前，治疗肺癌的主要方法包括手术、放疗和化疗，但5年存活率仍仅16％。对肺癌发病机制的深入研究并探寻新的分子靶标，对防治肺癌和降低死亡率具有重要意义。　　 分化抑制因子，又称DNA结合抑制因子(inhibitors of DNA binding/ differentiation，Id)，属于螺旋-环-螺旋(HLH)转录因子家族成员之一，Id蛋白与E蛋白结合形成二聚体后，可抑制E蛋白与其他组织特异性碱性HLH(bHLH)转录因子的结合，对bHLH转录因子活性起负调节作用。哺乳动物细胞含有四种Id分子，即Id1～Id4，编码基因分别定位于不同的染色体上。Id3作为血清诱导的立即早期基因参与多种细胞生物学过程，包括对细胞周期、分化及凋亡过程调控。　　 Id3表达异常与肿瘤、自身免疫性疾病、动脉粥样硬化等疾病的发生发展相关。Id3在不同组织种类的肿瘤中有着截然不同的表达谱，在原发性结直肠癌、星形细胞瘤和鳞状细胞癌中呈高表达，而在甲状腺癌、卵巢癌中表达呈下降趋势。Id3在肿瘤细胞中的表达及其与肿瘤恶性程度的关系目前尚未得到一致性的结论。目前认为，Id3基因表达调控途径和机制的复杂性决定了其功能的多样性，Id3蛋白对细胞周期的调控具有细胞种类和阶段特异性。因此，探讨作为细胞调控蛋白的Id3分子在某些病理生理状态下的生理、生物学功能具有重要意义。在前期研究中我们发现，Id3基因在人肺腺癌细胞株A549细胞中呈低表达水平，将外源性Id3基因导入A549细胞，可导致细胞生长抑制并诱导细胞凋亡。　　 本课题将采用微RNA(microRNA，miRNA)干扰技术，对人肺腺癌细胞株A549细胞内/外源性Id3的表达进行抑制，研究miRNA介导的Id3基因沉默对A549细胞增殖和凋亡的影响，进一步探讨Id3基因在A549细胞生长调控中的作用。　　 本研究根据靶基因Id3的mRNA序列，设计并合成4对靶向人Id3 mRNA的miRNA编码寡核苷酸(oligo)片段，构建4组miRNA干扰载体(pcDNA/miRId3-1，-2，-3，-4)。用脂质体转染技术将pcDNA/miRId3导入A549细胞，RT-PCR和Western blot结果显示，干扰载体pcDNA/miRId3能高效地抑制A549细胞中Id3 mRNA和蛋白质表达水平。随后，为进一步确认Id3转基因表达导致A549细胞增殖抑制和凋亡的作用，我们将筛选出的干扰效果较好的miRNA干扰质粒pcDNA/miRId3-1和pEGFP/Id3共转染A549细胞。RT-PCR和Western blot结果表明，pcDNA/miRId3转染或与pEGFP/Id3共转染A549细胞后，分别可对A549细胞内源性或外源性的Id3 mRNA和蛋白表达水平产生明显下调作用。MTT和Annexin V/7-AAD双染法结果表明，pcDNA/miRId3-1和pEGFP/Id3共转染A549细胞后，可以逆转外源性Id3基因表达致A549细胞增殖抑制和早期凋亡作用。　　 上述结果进一步证实，外源性Id3基因在A549细胞中的表达能够抑制细胞增殖并诱导凋亡，同时导入靶向Id3 mRNA的miRNA干扰质粒pcDNA/miRId3，可逆转外源性Id3表达对细胞增殖的抑制和致凋亡作用，有关其确切作用分子机制尚需进一步研究。重组miRNA表达载体的构建及应用为研究Id3转基因表达致A549细胞增殖抑制和诱导凋亡的作用机制奠定了实验基础。