随着经济高速发展,人们的生育意愿逐年降低,我国快速进入老年化社会,阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）患者稳步增加,屡创新高。由于AD患者认知功能障碍,不能生活自理,导致严重家庭经济负担以及巨大的社会压力。关于AD的诊断与研究,人类一直未曾间断,但是始终未研制出治疗AD相关特效药。尽管目前关于AD发病的有关假说众多,但Aβ级联假说一直是有关AD发病的最主要的假说。脑内Aβ的神经毒性引发神经元、突触的结构及功能损害。自噬-溶酶体途径在清除神经细胞内有害物质方面发挥着重要作用。近年研究显示,AD脑内存在神经营养不良性突起,其内有大量的不同阶段的自噬泡堆积,神经细胞胞浆内存在过量自噬溶酶体,因此自噬-溶酶体途径功能紊乱被认为是AD重要病理特征之一。AD自噬-溶酶体途径又被称为自噬流,包括自噬体形成、自噬体运输、自噬体与溶酶体融合及溶酶体降解数个阶段。神经突起远端是自噬体形成的部位,形成的自噬体需要沿微管系统逆行运输至胞体,通过溶酶体中的蛋白水解酶进行降解。AD神经细胞内自噬体及自噬溶酶体堆积的机制主要在于神经元逆行运输以及溶酶体降解功能受损。其中动力蛋白Dynein是自噬体逆行运输的唯一蛋白,组织蛋白酶D（Cathepsin D,CTSD）,是溶酶体中非常重要的蛋白降解酶。自噬-溶酶体途径是神经元内Aβ清除的重要途径之一。自噬-溶酶体途径功能紊乱与脑内Aβ水平密切相关。机体自噬-溶酶体途径可能是一柄双刃剑,正常自噬途径可以降解神经元内Aβ,但由于自噬泡膜上存在淀粉样前体蛋白（Amyloid precursorprotein,APP）及β、γ分泌酶,AD自噬-溶酶体途径紊乱所出现的自噬泡和自噬溶酶体堆积,可导致Aβ大量产生,加重AD病理变化及临床表现。针灸疗法绿色、安全,其对AD的治疗越来越受到人们的关注。AD相关针刺研究是近年针刺研究的热点。不论是临床试验亦或动物实验均显示了针刺疗法治疗AD的有效性。本课题组前期动物实验显示,电针干预治疗可有效降低APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ水平,提高小鼠的认知功能。本次实验,以6月龄APP/PS1双转基因小鼠为实验对象,观察电针干预6周对APP/PS1双转基因小鼠自噬-溶酶体途径动力蛋白Dynein、组织蛋白酶D（CTSD）的影响,从细胞内Aβ及自噬体逆行运输、溶酶体降解角度,探讨电针干预改善AD小鼠认知功能的作用机制。实验目的基于AD自噬-溶酶体途径紊乱发病机制,从细胞内Aβ及自噬体逆行运输、溶酶体降解角度探讨电针干预降低APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ水平的作用机制。实验方法采用随机数字表法,将20只6月龄SPF级雄性APP/PS1双转基因小鼠分为电针组和模型组,每组10只;10只6月龄SPF级雄性C57BL/6野生型小鼠作为空白对照组。电针组小鼠采用自制鼠袋俯卧位固定于操作台上,充分暴露小鼠头顶及双足足底,在小鼠顶骨正中取“百会”穴,两足底前、后1/3处取“涌泉”穴,选用北京中研太和医药公司生产的一次性针灸针,规格0.25 mm× 13mm,“百会”穴平刺进针2～3mm,“涌泉”穴直刺进针2～3 mm,双侧“涌泉”穴连接HANs韩氏电针仪（LH202H）,采用疏密波,频率1/50 Hz,电针强度1mA,以小鼠可以耐受不挣扎嘶叫为度,留针20 min/次;空白对照组和模型组小鼠采用与电针组小鼠相同的方法束缚20min/次。隔日1次,共干预治疗6周。干预结束后,采用Morris水迷宫实验检测小鼠空间学习和记忆能力;免疫组化观察小鼠海马Aβ以及动力蛋白中间链（Dynein intermedial chain,DIC）表达情况;ELISA实验检测小鼠脑内海马Aβ水平;采用透射电镜观察小鼠海马自噬体、自噬溶酶体情况;免疫荧光双标法观察小鼠海马CA1区CTSD和Aβ的共表达情况;免疫印迹实验（Western blot,WB）测定小鼠海马内DIC和CTSD的相对表达量。实验结果（1）Morris水迷宫检测结果显示,在定位航行实验中,与空白对照组相比,模型组小鼠平均逃避潜伏期增加,差异有统计学意义（P＜0.05）;与模型组相比,电针组小鼠平均逃避潜伏期减少,差异有统计学意义（P＜0.05）。在空间探索实验中,与空白对照组相比,模型组小鼠平均穿越平台次数和平台象限游泳路程均减少,差异均有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）;与模型组相比,电针组小鼠平均穿越平台次数和平台象限游泳路程均增加,差异均有统计学意义（P＜0.05,P＜0.01）;提示电针可以提高APP/PS1双转基因小鼠空间学习和记忆能力。（2）Aβ免疫组化实验结果显示,模型组、电针组小鼠海马可见呈阳性表达的老年斑,Aβ还阳性表达于小鼠海马神经元胞体和部分突起;ELISA实验结果显示,与空白对照组相比,模型组小鼠脑内Aβ42水平升高,差异有统计学意义（P＜0.01）;与模型组相比,电针组小鼠脑内Aβ42水平降低,差异有统计学意义（P＜0.01）;提示电针干预可有效降低APP/PS1双转基因小鼠脑内Aβ水平。（3）透射电镜实验结果显示,空白对照组小鼠海马可观察到少量的自噬溶酶体;模型组小鼠海马可见营养不良性突起,其中有大量自噬体堆积,胞体核周可见许多自噬溶酶体聚集;电针组小鼠海马也可见营养不良性突起,其中有自噬体堆积,胞体核周可见部分自噬溶酶体聚集。（4）DIC免疫组化实验结果显示,Dynein主要表达在小鼠海马胞体和突起。Western blot结果显示,与空白对照组相比,模型组小鼠海马动力蛋白中间链（DIC）相对表达量降低;与模型组相比,电针组小鼠海马动力蛋白中间链（DIC）相对表达量增加,差异均有统计学意义（P＜0.01）。免疫荧光双标法结果显示,CTSD和Aβ在小鼠海马CA1区神经元内存在共表达。Western blot结果显示,与空白对照组相比,模型组小鼠海马CTSD相对表达量增加;与模型组相比,电针组小鼠海马CTSD相对表达量降低,差异均有统计学意义（P＜0.01）。提示电针可提高APP/PS1双转基因小鼠脑神经元逆行运输及溶酶体降解能力。结论促进自噬体逆行运输及自噬溶酶体降解,调节小鼠紊乱自噬状态,可能是电针降低小鼠脑内Aβ水平,改善AD小鼠空间学习和记忆能力的机制之一。