【摘 要】
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本文主要以蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）作为试验研究对象,对其NS4基因进行原核表达载体的构建,并实现NS4蛋白的大量、高效表达。然后进一步制备BTV NS4原核表达重组蛋白多克隆抗体。最后以纯化后的融合蛋白p ET-32a-NS4为包被抗原,筛选最佳包被量、血清最佳稀释度、最佳封闭液、酶标抗体最佳工作浓度以及反应临界值,建立基于NS4蛋白的BTV间接ELISA检测方法,并
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本文主要以蓝舌病病毒（Bluetongue virus,BTV）作为试验研究对象,对其NS4基因进行原核表达载体的构建,并实现NS4蛋白的大量、高效表达。然后进一步制备BTV NS4原核表达重组蛋白多克隆抗体。最后以纯化后的融合蛋白p ET-32a-NS4为包被抗原,筛选最佳包被量、血清最佳稀释度、最佳封闭液、酶标抗体最佳工作浓度以及反应临界值,建立基于NS4蛋白的BTV间接ELISA检测方法,并对56份牛临床血清样品进行抗体检测分析。本研究主要研究内容及结果如下:（1）BTV NS4基因原核表达载体的构建与表达本研究利用PCR扩增得到NS4基因,与空载体p ET-32a双酶切后连接,构建p ET-32a-NS4原核表达载体;将p ET-32a-NS4转化至E.coli BL21感受态细胞,以IPTG诱导表达;结果表明,成功构建p ET-32a-NS4原核表达载体;IPTG最佳诱导浓度为0.8mmol/L,时间为6h,重组蛋白主要以包涵体形式表达;Western blot表明,在27k D可见目的条带,与预期相符。成功构建p ET-32a-NS4原核表达载体,实现NS4蛋白的大量、高效表达,为进一步制备NS4蛋白的抗体奠定了基础。（2）BTV NS4原核表达重组蛋白多克隆抗体的制备将纯化后的融合蛋白p ET-32a-NS4免疫新西兰大白兔以制备多克隆抗体。结果表明:抗体效价为1:512000以上,纯度高于85%,获得纯化抗体得率8.0 mg以上。以p ET-32a-NS4重组蛋白制备抗原接种新西兰大白兔,获得具有较好免疫原性多克隆抗体,为BTV NS4蛋白检测及间接ELISA方法的研究奠定了基础。（3）BTV NS4蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立以纯化后的融合蛋白p ET-32a-NS4为包被抗原,筛选最佳包被量、血清最佳稀释度、最佳封闭液、酶标抗体最佳工作浓度以及反应临界值,建立基于NS4蛋白的BTV间接ELISA检测方法,并对56份牛临床血清样品进行抗体检测分析。结果表明:检测的样品抗体阳性符合率为100%,基于NS4建立的间接ELISA检测方法具有良好的灵敏度及重复性。
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