【摘 要】
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目的:湿性年龄相关性黄斑变性（wet age related macular degeneration,w AMD）是老年人群中致盲的主要原因,视网膜下纤维化形成是其视力损伤的重要因素。但是视网膜下纤维化形成的分子机制尚不明确。本研究主要探讨mmu＿circ＿0001103如何调控巨噬细胞向肌成纤维细胞转化从而介导视网膜下纤维化的形成,以期为视网膜下纤维化防治提供实验依据。方法:（1）建立激光诱导
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目的:湿性年龄相关性黄斑变性（wet age related macular degeneration,w AMD）是老年人群中致盲的主要原因,视网膜下纤维化形成是其视力损伤的重要因素。但是视网膜下纤维化形成的分子机制尚不明确。本研究主要探讨mmu＿circ＿0001103如何调控巨噬细胞向肌成纤维细胞转化从而介导视网膜下纤维化的形成,以期为视网膜下纤维化防治提供实验依据。方法:（1）建立激光诱导脉络膜新生血管（choroidal neovascularization,CNV）小鼠模型,通过对CNV小鼠和正常小鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体进行测序,验证和生信分析,得到差异性circRNAs;（2）TGF-β1（2.5 ng/ml）诱导RAW264.7细胞向肌成纤维细胞转化（Macrophage-to-Myofibroblast Transition,MMT）,RT-PCR和免疫蛋白印迹（Western Blot）检测MMT标志物α-SMA和FSP-1的表达;（3）细胞核质分离实验和荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization,FISH）实验鉴定差异表达的环状RNA mmu＿circ＿0001103的表达和定位;（4）转染小干扰RNA（Small interfering RNA;siRNA）以降低mmu＿circ＿0001103表达,RT-PCR和免疫蛋白印迹检测转染后的MMT中α-SMA和FSP-1表达;（5）生信分析预测mmu＿circ＿0001103可以结合的miRNAs,通过RT-PCR验证miRNAs在组织和细胞里的表达;（6）利用RIP实验验证miRNA和circRNA的海绵吸附机制;进一步通过双荧光素酶实验证明miRNA-circRNA-靶基因的作用机制;（7）脉络膜铺片、HE染色观察CNV和视网膜下纤维化的形成,干预mmu＿circ＿0001103后观察MMT及CNV和视网膜下纤维化的改变。结果:（1）对CNV小鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体进行测序分析,鉴定出58个显著变化的环状非编码RNA（P＜0.01,倍数变化＞2.0）;RT-PCR验证circRNAs,发现CNV形成后7天、14天和28天RPE-脉络膜-巩膜复合体中mmu＿circ＿0001103均表达增加（P＜0.01）;（2）TGF-β1诱导小鼠来源巨噬细胞系RAW264.7向肌成纤维细胞转化后,α-SMA和FSP-1的基因和蛋白表达均呈现增加趋势（P＜0.05）,mmu＿circ＿0001103表达量也随之增加（P＜0.01）;（3）核质分离和FISH实验发现,环状RNA mmu＿circ＿0001103主要定位于细胞质中;（4）mmu＿circ＿0001103敲低后,MMT细胞的标志物α-SMA和FSP-1减少（P＜0.05）;（5）生信预测显示mmu-miR-7240-5p与mmu＿circ＿0001103存在结合位点,且相较于正常组,RT-PCR显示mmu-miR-7240-5p在激光诱导CNV小鼠后7天、14天和28天组织以及MMT中均降低（P＜0.01）;（6）RIP实验中,相较于Ig G组,Ago2蛋白吸附mmu＿circ＿0001103和mmu-miR-7240-5p（P＜0.01）;而双荧光素酶中circ＿0001103野生型+miR-7240-5p mimic组和SLC9A野生型+miR-7240-5p mimic组均降低（P＜0.01）,证实miRNA-circRNA-SLC9A1存在海绵吸附作用;（7）玻璃体腔注射mmu＿circ＿0001103病毒,发现降低mmu＿circ＿0001103表达后,第7天、14天和28天的CNV小鼠中,新生血管和纤维化病灶范围均减小（P＜0.05）;MMT的标志物α-SMA和FSP-1降低（P＜0.05）。结论:mmu＿circ＿0001103通过吸附mmu-miR-7240-5p调控SLC9A1介导巨噬细胞向肌成纤维细胞转化和视网膜下纤维化的形成;通过干预mmu＿circ＿0001103可以调控巨噬细胞向肌成纤维细胞转化和视网膜下纤维化的形成。
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