目的：食道癌（esophageal cancer,EC）是世界范围内常见的威胁人类健康的恶性肿瘤之一,在最常见的癌症中位列第八,在癌症相关死亡中位列第六。EC主要有两个亚型:食道鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）和食道腺癌（esophageal adenocarcinoma,EAC）,其中ESCC是主要的组织学类型,约占90%。ESCC起病隐匿,早期诊断率低,具有局部浸润性生长、早期发生淋巴结转移及血管侵袭等特点,尽管可以手术治疗或放化疗,ESCC的预后不佳,整体5年生存率仅有15-25%,因此,我们需要更清楚地了解ESCC发病机制,找到无创、高效、灵敏的早期筛查标记物,以争取提高早期诊断率,选择合适的有针对性的治疗手段以改善预后。已有研究证实异常的遗传学及表观遗传学变化参与了ESCC的发生发展。DNA甲基化,组蛋白修饰和功能性非编码RNA是常见的表观遗传修饰,可以调控基因表达,其中研究最多最广泛的是DNA甲基化,即在DNA甲基转移酶的作用下,在基因组启动子区域CpG（cytosin-phosphate-guanosine）二核苷酸的胞嘧啶第五碳位共价键结合一个甲基基团。在脊椎动物中,约50%基因的启动子上有CpG岛,该区域常发生异常高甲基化,引起基因表达及生理功能的异常。深入的肿瘤学和表观遗传学研究发现,抑癌基因可因启动子甲基化表达沉默而促进肿瘤的发生发展。基因芯片技术是90年代中期以来飞速发展起来的分子生物学高新技术。DNA甲基化检测手段历经了从最初的甲基化特异性PCR针对单个候选基因的检测到利用甲基化芯片对疾病的全基因组DNA甲基化水平进行宏观检测,目前的研究中应用比较广泛的是Illuminate平台的Illumina Human Methylation EPIC Bead Chip（850k）芯片,该芯片是用于全表观基因组关联研究的重要手段,覆盖超过85万个CpG位点,在单核苷酸水平上对整个基因组的甲基化位点进行定量检测。Septin属于丝状蛋白家族,该家族基因最早被发现于酿酒酵母中,在人类中Septin家族包括13个成员。SEPT9作为该家族中的一员,位于人类染色体17q25.3,普遍存在于真核生物中,参与细胞骨架重构、细胞质分裂、微管调节、囊泡运输及胞外分泌作用。在不同肿瘤中SEPT9表达水平和生理功能各不相同,并且有多个研究发现SEPT9在恶性肿瘤中存在甲基化异常,而其在ESCC中的表达和作用报道甚少。外周血cfDNA（cell free DNA）检测用于肿瘤的无创诊断技术,目前主要应用于癌基因及抑癌基因突变的检测,临床常用的检测基因包括EGFR,APC,HRAS,MET,TP53,KRAS,BARF等。已有研究证实外周血cfDNA异常的甲基化可以作为恶性肿瘤早期、无创筛查的新指标,多篇文献报道了ESCC组织中存在多种基因的过甲基化表达,然而ESCC外周血cfDNA甲基化情况报道很少。本研究中我们拟利用Illumina平台850k芯片对ESCC组织进行差异甲基化位点及区域进行筛选,根据筛选结果验证目标基因在ESCC中的甲基化及表达情况,并进一步探究其参与ESCC发生发展的机制。研究方法：1、实验材料:（1）ESCC及癌旁新鲜冰冻组织。（2）ESCC患者外周血及对照组病例外周血。（3）人类食道鳞状细胞癌KYSE-150、TE-1细胞系。（4）Real-time PCR相关试剂及仪器。（5）Western印迹相关试剂及仪器。（6）细胞培养所需试剂及仪器。（7）SEPT9表达载体:SEPT9过表达质粒。（8）组织、外周血DNA提取试剂盒。（9）免疫组织化学相关试剂、仪器。2、实验方法:（1）采用Illumina Human Methylation EPIC Bead Chip（850k）芯片对4对ESCC及癌旁组织的差异甲基化位点及区域进行筛查,结合UALCAN数据库及文献信息对SEPT9在ESCC中的表达及甲基化水平进行验证。（2）Real-time PCR方法检测ESCC组织及癌旁正常食道组织中、ESCC患者及对照组患者外周血中SEPT9甲基化水平。（3）Western Blot检测ESCC及癌旁组织中SEPT9蛋白质的表达水平。（4）免疫组织化学方法检测ESCC及癌旁组织中SEPT9蛋白质的表达情况。（5）构建SEPT9过表达质粒,转染ESCC细胞系KYSE-150、TE-1。（6）利用划痕愈合实验、Transwell实验、CCK-8、细胞凋亡实验鉴定SEPT9在细胞迁移、侵袭、增殖和凋亡中的作用。（7）Western Blot检测转染细胞GSK-3β磷酸化蛋白水平变化,鉴定GSK-3β活性是否改变。（8）Western Blot检测转染细胞核内β-catenin蛋白表达,验证过表达SEPT9能否导致β-catenin核转位异常;加入GSK-3β活性抑制剂（TWS119）,鉴定β-catenin蛋白表达是否回调。结果：1、采用Illumina Human Methylation EPIC Bead Chip（850k）芯片对4对ESCC组织及配对癌旁组织进行差异甲基化位点及区域筛查,共筛查出差异甲基化位点189489个,其中高甲基化位点53307个,低甲基化位点136182个,差异甲基化区域261个。选取排名前30的区域,共有34个基因位于其中,整合公共数据库UALCAN中的ESCC甲基化芯片数据,筛选出6个基因:ZNF132、SEPT9、ZIC1、ZIC4、USP4以及ZNF154。查找以上6个基因甲基化差异最明显的探针位点,并将其在所有筛选出的位点中按照甲基化程度的降序进行排序,发现SEPT9的代表位点cg20309069在所有筛选出的189489个位点中位列18,位列上述6个基因中的首位,拟在下一步研究中验证SEPT9在ESCC中的甲基化及表达情况。2、在31对ESCC组织及癌旁组织中进行SEPT9甲基化检测,发现SEPT9在ESCC组织中甲基化水平（1.20±1.92）较癌旁食道组织（3.64±1.92）明显升高,绘制ROC曲线,曲线下面积0.8293。3、在外周血水平,我们发现81%（51/63）的ESCC患者和6%（4/71）的对照组患者存在异常升高的SEPT9甲基化,ESCC组患者的甲基化水平（10.42±4.36）较对照组（16.72±1.68）病例明显升高,绘制ROC曲线,曲线下面积0.8390。4、对63例ESCC患者的临床数据进行分组分析,发现外周血游离DNA中SEPT9异常升高的甲基化与ESCC的淋巴结转移、TNM分期相关,且SEPT9甲基化发生在肿瘤形成早期。5、Western Blot实验证实了SEPT9蛋白在ESCC组织中的表达（0.1804±0.0630）较癌旁正常食道组织（0.8431±0.1596）降低;免疫组化实验证实在200倍视野下,ESCC中（3.7587±1.3241%）SEPT9阳性面积百分比较癌旁组织（54.4580±2.6059）明显降低。6、构建SEPT9过表达载体,分别转染ESCC细胞系KYSE150及TE-1,通过划痕愈合实验、Transwell实验、CCK-8实验及凋亡实验证实,过表达SEPT9抑制ESCC细胞的迁移、侵袭和增殖能力,促进其凋亡。7、转染ESCC细胞系SEPT9过表达质粒及空载体Vector,结果证实,在KYSE-150及TE-1细胞系中,过表达组的GSK-3β在Ser9位点表达水平较Vector组降低,说明SEPT9过表达增强了GSK-3β的激酶活性。8、ESCC细胞系转染SEPT9过表达质粒后,细胞核内β-catenin蛋白质水平的表达明显降低,在加入TWS119后,细胞核β-catenin蛋白表达水平出现回复。结论：1、ESCC患者外周血中存在着与组织中相一致的SEPT9甲基化水平升高,并且是肿瘤发生的早期事件,外周血游离DNA中甲基化水平的高低与ESCC是否合并淋巴结转移及TNM分期相关,为ESCC的早期、无创、高效筛查提供了一种新的可能。2、我们的研究数据表明SEPT9蛋白质在ESCC组织中低表达,这可能是由于SEPT9在ESCC组织中过度甲基化造成的。3、过表达SEPT9可抑制ESCC细胞增殖、转移和侵袭能力,但促进其凋亡,在ESCC中它可能是通过调节GSK-3β的活性起到抑制Wnt/β-catenin信号通路从而发挥抑癌基因的作用。