论文部分内容阅读
宫颈癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,其发病率仅次于乳腺癌。对于肿瘤的治疗,目前手术、化疗、物理等疗法,都存在不同程度的缺陷,为此人们一直在寻求更为有效的肿瘤治疗策略。近年来脉冲电磁场以其独特的电穿孔效应在基因转染、诱导细胞凋亡[1-2]等方面成为研究的热点。脉冲电场以其独特的诱导细胞电穿孔以及不可逆性电击穿等生物电效应成为电气科学家、细胞生物学家和临床医师等研究并调控细胞生物效应开辟了一条新途径,其对肿瘤的综合治疗方面展现出良好的发展前景并在临床中得到了初步应用。野生型p53基因是公认的抑癌基因,其编码p53蛋白在体内以四聚体形式存在。在细胞DNA受损伤时,p53蛋白与DNA相应部位结合,使细胞停滞于Gl期,抑制解链酶活性,并与复制因子A相互作用,参与DNA的复制与修复,以便细胞有足够的时间修复损伤。如果修复失败,则通过上调诱发凋亡的基因,促使细胞凋亡,从而防止细胞恶变。因此p53基因的功能失活在HPV致宫颈癌过程中扮演重要角色[3]。本研究旨在通过体外实验,探讨通过脉冲电场转染含野生型p53基因的质粒进入宫颈癌Hela细胞,观查p53基因对hela细胞的抑制效应,然后以筛选出的参数组合的脉冲电场作用于转染p53质粒的Hela细胞,观察其诱导细胞凋亡的效应。第一部分脉冲电场介导的p53基因转染hela细胞及对hela细胞的影响目的:利用脉冲电场转染含有野生型p53基因的质粒入人宫颈癌Hela细胞,得到稳定表达P53蛋白的Hela-p53细胞,并观察p53基因对Hela细胞生长的影响。方法:取用已经优化的参数组合才脉冲电场转染含有p53基因的质粒及空质粒至人宫颈癌HeLa细胞内;通过质粒Zeocin抗性筛选出具有p53基因和空质粒的HeLa细胞(HeLa-p53和HeLa-vector);对转染的细胞用RT-PCR及Wsetern bolt进行鉴定;筛选得到目标细胞后,细胞计数及MTT法检测各组细胞的生长情况,绘制细胞生长曲线,MTT检测比较HeLa、HeLa-vector和HeLa-p53生长活力。结果:转染得到稳定表达P53蛋白的Hela-p53细胞及Hela-vector细胞;Hela-p53细胞生长活性明显低于另外两组细胞。结论:一定参数组合的脉冲电场可以转染质粒进入Hela细胞;p53基因对Hela细胞的生长起到抑制作用。第二部分脉冲电场诱导宫颈癌hela细胞凋亡的参数筛选目的:观察一系列参数组合的脉冲电场对人宫颈癌Hela细胞的抑制及诱导凋亡作用;优化脉冲电场诱导Hela细胞凋亡的电场参数组合;同时检测脉冲电场作用后细胞悬液的温升,探讨热效应在脉冲电场抑制及诱导Hela凋亡中的作用。方法:选择电场参数为频率为1Hz,脉冲宽度为100μs,每次作用8个脉冲,场强分别为500、750、1000、1250、1500、1750、2000(v/cm),设对照组,共8组,分别作用于Hela细胞,电场作用后12h及24h后苔盼蓝计数法检测细胞存活率;24小时后MTT检测细胞活力;流式细胞术检测各参数作用12h后细胞凋亡。热偶器测量电场作用后细胞悬液温升。结果:苔盼蓝计数细胞存活率,与对照组比较500-1000v/cm组无明显差异(P>0.05),1250-2000v/cm组差异显著(P<0.05),1250、1500v/cm组与1750、2000v/cm组比较差异显著(P<0.05);MTT检测细胞活力结果类似细胞计数结果。2000v/cm组实际温升约为4.5℃。结论:脉冲电场对细胞有确切的抑制作用,其中包含着坏死和凋亡作用;脉冲电场诱导细胞凋亡存在一个电场参数范围;脉冲电场抑制细胞作用过程中,热效应作用不明显。第三部分脉冲电场联合P53基因诱导hela细胞凋亡的研究目的:以第二部分筛选的参数组合的脉冲电场,分别处理Hela、Hela-vector、Hela-p53细胞,观察各组细胞凋亡。方法:流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;western bolt检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2在各组细胞中的表达;激光共聚焦显微镜检测casepase-3蛋白在各组细胞中的表达。结果:流式细胞仪检测发现Hela-p53组细胞凋亡率明显大于另两组细胞;Western bolt检测发现Hela-p53细胞中促凋亡蛋白Bax表达显著高于Hela、Hela-vector细胞,而抑制凋亡蛋白Bcl-2则相反;凋亡相关蛋白Casepase-3在Hela-p53细胞的表达明显高于另两组。结论p53基因可以增强脉冲电场诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的效应。