家蚕(Bombyx mori)自古以来就是一种重要的经济昆虫,最近以来,家蚕又成了鳞翅目昆虫重要的模式生物。家蚕转基因技术在培育新品种、生物反应器的开发以及功能基因组学研究等方面具有重要应用价值,家蚕转基因育种技术的研究开发和利用已经成为蚕业科技界关注的焦点,而转基因阳性个体的高效检测技术是建立家蚕高效转基因技术的核心之一。本课题研究的家蚕第二白卵(w-2:10-16.1)突变体的卵色和眼色与正常型十分容易区分,第二白卵对孵化、生命力、经济性状等方面的影响都很小,适合用作转基因个体筛选的标志基因。但之前对家蚕第二白卵形成的分子机制尚无了解,因此,我们利用野生型黑卵及其第二白卵近等基因系,联合运用全基因组芯片技术和实时荧光定量PCR技术,探索家蚕第二白卵性状相关的基因信息,以期为进一步阐明第二白卵性状形成的分子机制、开发新型转基因标记技术提供参考。主要研究结论如下:一、家蚕全基因组芯片高通量检测家蚕第二白卵(w-2)性状相关的差异表达基因采用由西南大学和博奥生物有限公司共同构建、含有23000个基因的家蚕全基因组寡聚核苷酸芯片进行检测。以表达差异≥2.0或≤0.5倍为标准,获得24h卵龄的第二白卵与野生型黑卵差异表达基因163个,获得48h卵龄的第二白卵与野生型黑卵差异表达基因186个。其中在24h和48h黑卵和白卵间表达差异最大的基因均为芯片探针sw04840对应的基因,差异倍数分别为32.4675和22.8311倍。二、差异表达基因的实时荧光定量PCR分析根据全基因组芯片检测分析获得的结果,挑选部分差异较大的基因以及w-2基因所在的第10连锁群上的差异表达基因,对芯片检测获得的差异表达候选基因在家蚕第二白卵与野生型黑卵品系转色期(24h和48h)蚕卵的表达水平进行实时荧光定量RT-PCR验证分析,结果表明大部分基因定量结果与芯片结果倾向一致,极少部分与芯片结果相反。其中基因芯片结果中表达差异最大的sw04840基因在real-time RT-PCR实验结果中也是差异最大的基因,在24h和48h的表达差异达到424.61和797.86倍,为正常型黑卵上调表达基因。通过进一步分析得知,该基因在是一个在黑卵中大量表达的基因,在24h和48h的黑卵中的表达量分别为内参基因Bmactin A3的1.92倍和0.73倍。另外,基因sw00132和基因sw04534在蚕卵发育的第48小时在黑白卵中的差异倍数也达到了数百倍,其中,基因sw00132为黑卵上调表达基因,sw04534则为白卵上调表达基因。在蚕卵发育的第24小时的白卵上调表达基因中,sw13775是差异最大的基因。三、候选基因的电子克隆和RACE延伸对于上述的4个基因,我们用它们各自探针序列,通过家蚕EST数据库对这四个基因进行电子延伸,并通过克隆测序验证拼接的正确性,结合3’RACE的测序结果拼接后得到了这四个基因的更多的序列信息。它们都包含了一个较长的开放阅读框的序列,sw13775,sw00132和sw04840这3个探针对应的基因获得了完整的3’端序列。四、候选基因的序列分析和其编码蛋白分析将这4个基因电子克隆和RACE延伸后的基因序列进行基因结构分析,发现sw13775和sw00132对应的基因是含有多个外显子的基因,但sw04840和sw04534对应的基因目前仅获得1个外显子。并且sw04840在家蚕基因组精细图数据库中也没有找到与之高度同源的序列,为家蚕中新发现的一个在黑白卵中表达差异很大的一个基因。在NCBI等数据库中对4个候选基因进行BLASTX分析,发现sw13775对应的是家蚕乙醛还原酶(alcohol dehydrogenase)基因,sw00132与多种昆虫中的醛脱氢酶基因家族7中的一个基因高度同源,而sw04840和sw04534则没有找到与之高度同源的基因。通过所编码氨基酸序列的生物信息学分析,sw04534可能编码一种胞内酶,而sw04840则很可能不是一个编码酶蛋白的基因。