桑树是蔷薇目（Rosales）桑科（Moraceae）桑属（Morus）桑种（Morus spp.）的多年生木本植物。桑树具有重要的经济价值和药用价值,在中国至少有5000年的栽培历史。中国作为桑树的主要起源地,桑种的分布最多,资源的丰富度也最高。长期复杂的人工选育过程导致栽培桑树的遗传背景异常复杂。由于桑树染色体形态均为点状（除川桑和滇桑以外）,不仅制备困难,染色体之间也难以区分。前期研究中,研究人员首次发现了桑树中存在于个体内世代交替过程中的染色体融合断裂循环的现象,且融合与断裂发生在5号染色体和7号染色体的端部,可被25S rDNA定位。为探究其具体分子机制,本研究利用拟南芥型端粒探针At-tel和25S rDNA探针,对川桑染色体的断裂融合位点进行染色质纤维荧光原位杂交（Fiber-FISH）分析,从而获得更高分辨率的结果。通过着丝粒探针Mn-175、着丝粒特异性组蛋白Mn CENH3和端粒探针At-tel、端粒结合蛋白（Mn TRB1,Mn POT1a和Mn POT1b）在川桑不同时期染色体上的共定位,跟踪并解析着丝粒在融合断裂过程中的动态变化,尝试解读桑树染色体融合断裂循环的详细机制,为桑树的分子细胞遗传学研究提供了数据支持。所得研究结果如下:1、川桑染色体断裂融合位点的Fiber-FISH利用25S rDNA探针和端粒探针At-tel,得到更精细的中期5号和7号染色体的25S rDNA探针定位端的染色体序列分布情况。在25S rDNA探针和拟南芥型端粒探针的共定位区域,25S rDNA探针覆盖了大部分染色质纤维,端粒探针的信号主要以短小且分散的点状信号分布其中,可能反映的是间质端粒序列。因此推测:（1）在中期5号和7号染色体25S rDNA序列附近存在少量的拟南芥型端粒重复序列单元,但不存在大量的拟南芥型端粒重复序列（典型的植物端粒重复序列）;（2）川桑中期5号和7号染色体的25S rDNA探针定位端可能存在其他类型的端粒序列。2、川桑着丝粒和端粒结合蛋白的免疫荧光分析利用生物信息学的方法在川桑基因组中筛选到3个端粒结合蛋白Mn TRB1,Mn POT1a和Mn POT1b,原核表达的蛋白经纯化后制备抗体。4个蛋白抗体,再结合实验室前期制备的Mn CENH3的抗体进行免疫荧光实验,追踪在减数分裂不同时期和有丝分裂中期川桑着丝粒和端粒的位置变化。着丝粒方面,在整个减数分裂过程中,Mn CENH3抗体的信号能覆盖大部分染色质区域,但每个细胞相中会有1-2个强信号点。而在有丝分裂中期的Mn CENH3荧光信号的强弱程度区别更加明显:12条染色体中,有一对染色体上没有出现荧光信号,还有一对染色体上仅有微弱的绿色荧光信号;有3条染色体上出现强荧光信号。说明即使处在同一个时期,川桑不同染色体上的着丝粒的活跃程度也是不同的。暗示在川桑中染色体断裂融合循环的发生可能与着丝粒有关。与Mn CENH3抗体杂交结果不同,端粒结合蛋白Mn TRB1,Mn POT1a和Mn POT1b的抗体免疫荧光结果如下:减数分裂不同时期,仅能观测到微弱的免疫荧光信号,且荧光信号的数目与位置并不稳定。无法利用Mn TRB1,Mn POT1a和Mn POT1b的蛋白抗体追踪其位置,一方面可能由于制备的端粒结合蛋白抗体效价太低;另一方面,以上3个蛋白质的表达丰度较低,可能也是影响免疫荧光信号较低,实验结果难以重复的原因。后续研究仍需进一步优化实验体系,分析和排查实验结果不理想的原因。3、着丝粒和端粒结合蛋白与EGFP构建融合蛋白进行定位构建桑树Mn CENH3、Mn TRB1,Mn POT1a和Mn POT1b蛋白与EGFP的融合蛋白表达载体,利用农杆菌侵染进桑苗植株体内,成功表达后进行位置示踪,从而解读在染色体融合断裂循环所处的不同时期着丝粒和端粒的位置变化。4个EGFP融合蛋白在根尖成功表达。与对照株相比,实验株根尖有明显绿色荧光。用成功表达EGFP融合蛋白的根尖制备染色体,通过使用探针Mn-175和At-tel进行FISH实验之后,发现EGFP的荧光非常微弱,对于指示端粒蛋白的确切位置和分析不同时期端粒蛋白的位置变化情况,难以获得令人信服的实验结果。多次重复实验后仍不能得到较为有效的结果。推测可能是EGFP融合蛋白本身不够稳定,或是导致EGFP融合蛋白变性失去荧光标签等原因,造成实验体系的不稳定。本研究结合核酸探针Mn-175与特异性蛋白Mn CENH3抗体,对川桑的着丝粒进行多个细胞时期的位置追踪分析。鉴定筛选了3个川桑的端粒结合蛋白Mn TRB1,Mn POT1a和Mn POT1b并制备抗体,并对川桑端粒在不同时期的位置进行追踪,虽未取得较为理想的结果,但为今后的川桑端粒蛋白研究提供了实验基础。本研究也构建了EGFP融合蛋白载体并在桑树根尖中成功表达,虽然后续的FISH实验并不十分理想,但为往后的川桑端粒相关蛋白研究和着丝粒研究提供了实验数据基础和后续研究展望。荧光原位杂交实验的难度高,尤其对于木本植物川桑而言,获取不同时期的材料还存在时间和季节限制。通过荧光原位杂交技术与免疫荧光等技术的结合展示着丝粒和端粒的相关位置信号,这进一步提高了实验的难度系数。尽管本研究未能得到高分辨率的研究结果,但是不失为可行的尝试。