【摘 要】
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外泌体是细胞主动分泌的直径为40-160 nm的细胞外囊泡,广泛分布于各种体液中,携带母细胞相关蛋白、核酸和脂质等生物学信息。外泌体具有异质性,不同细胞系甚至同株细胞系分泌的外泌体尺寸和内容物均存在较大差异。肿瘤外泌体由肿瘤细胞分泌,是一种重要的液体活检生物标志物。因此,分析肿瘤外泌体所携带的生物信息对肿瘤等重大疾病的诊断和预后监测至关重要。然而,传统的外泌体检测方法主要为整体分析法,仅提供外泌体
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外泌体是细胞主动分泌的直径为40-160 nm的细胞外囊泡,广泛分布于各种体液中,携带母细胞相关蛋白、核酸和脂质等生物学信息。外泌体具有异质性,不同细胞系甚至同株细胞系分泌的外泌体尺寸和内容物均存在较大差异。肿瘤外泌体由肿瘤细胞分泌,是一种重要的液体活检生物标志物。因此,分析肿瘤外泌体所携带的生物信息对肿瘤等重大疾病的诊断和预后监测至关重要。然而,传统的外泌体检测方法主要为整体分析法,仅提供外泌体群体测定结果的平均值,易掩盖血液中数量占比较少的肿瘤外泌体的信息。开发适用于临床样本测定的外泌体单颗粒分析新方法,是目前该领域的研究热点。本论文基于外泌体单颗粒表面蛋白和内部核酸的检测,建立了外泌体单颗粒多参数分析新方法,并将其应用于临床肿瘤患者血浆样本的测定,为肿瘤外泌体作为液体活检生物标志物用于癌症诊断的研究提供新思路。具体研究内容和主要成果如下:1.针对单一标志物难以准确定量血浆肿瘤外泌体的问题,本论文发展一种外泌体单颗粒多蛋白数字化分析方法（digital profiling of proteins on individual exosomes,DPPIE）,成功实现对癌症患者血浆样本中外泌体单颗粒表面蛋白CD63/EpCAM/MUC1的原位荧光信号放大检测。使用anti-CD9抗体修饰的生物芯片直接捕获血浆外泌体,使外泌体单个散落地分布在芯片表面;利用CD63核酸适体再次识别确认,消除游离蛋白的干扰并确保检测的准确性;再使用EpCAM核酸适体和MUC1核酸适体识别外泌体上的特征肿瘤标志蛋白,设计基于滚环扩增反应的荧光原位信号放大策略,可视化分析外泌体单颗粒表面的多种蛋白,实现CD63/EpCAM/MUC1三蛋白阳性外泌体的灵敏检测。该方法的检测限可低至10 vesicles/μL,灵敏度远高于酶联免疫吸附试验和基于表面等离子体共振的商业化生物传感器。结合T分布随机近邻嵌入聚类分析,DPPIE法能更准确地区分乳腺癌患者和健康志愿者的血浆样本,并能用于肺腺癌和肺鳞癌等肿瘤亚型的精准分型。使用DPPIE法,发现B淋巴细胞白血病和T淋巴细胞白血病患者的血浆中存在CD63/EpCAM/MUC1三蛋白阳性外泌体,可作为血液系统恶性肿瘤诊断的潜在生物标志物。此外,DPPIE法具有简便和通用的优势,可通过改变核酸适体或抗体,广泛应用于检测外泌体上的其它特征肿瘤标志蛋白,有望用于临床多种肿瘤的诊断和分类。2.针对外泌体单颗粒表面蛋白和内部核酸难以同时测定的问题,本论文发展一种肿瘤外泌体亚群PD-L1单颗粒原位荧光信号放大成像分析新方法（localized profiling of tumor-derived individual exosomal PD-L1,LPTIE）,基于脂质体介导的膜融合策略和核酸链交换反应信号扩增（signal amplification by exchangereaction,SABER）技术,实现外泌体双靶标（表面蛋白PD-L1和内部核酸miR-21）的同时测定。制备anti-CD9/anti-CD63/anti-CD81联合抗体修饰的生物芯片,直接高效捕获血浆外泌体,排除游离PD-L1蛋白的干扰;包封分子信标的膜融合脂质体与外泌体融合,检测外泌体内部核酸miR-21特异识别肿瘤外泌体亚群,排除正常细胞外泌体的干扰;利用SABER技术,放大外泌体表面蛋白PD-L1的荧光信号,实现血浆肿瘤外泌体亚群PD-L1的灵敏检测。结合索贝尔算子机器学习算法处理分析获得的外泌体核酸和蛋白数据,确定肿瘤外泌体亚群PD-L1占外泌体群体的比例。通过检测临床血浆样本发现,相比于酶联免疫吸附试验和纳米颗粒追踪分析技术,LPTIE法能更准确地区分乳腺癌患者和健康志愿者的血浆样本,也能将乳腺癌患者和乳腺良性肿瘤患者的血浆样本区分开。此外,通过增加分子信标和核酸适体,该方法可用于检测外泌体内部多种核酸和表面蛋白,为实现更精准的癌症诊断和免疫治疗预后监测提供新策略。
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