腰背痛（Low back pain,LBP）是全球最严重的医学和社会问题之一,百分之八十以上的成年人在一生中经历过腰背痛。由椎间盘退变引起的椎间盘突出或狭窄是腰背痛的重要原因。目前临床上治疗椎间盘退变的主要手段包括保守治疗和手术干预。然而,保守治疗和手术干预均只能减轻症状,不能从根源上阻止椎间盘退变的进展。因此急切需要寻找一种新的治疗手段来恢复椎间盘的功能,延缓椎间盘退变。成熟的椎间盘主要由缺乏血管的组织构成,外周毛细血管的营养供应非常有限,绝大多数营养需经过软骨终板的自由扩散获取。随着椎间盘退变的加重,软骨终板出现裂隙、炎症和钙化,终板软骨细胞数目减少,营养通道的供给被中断,继续加重椎间盘退变,形成恶性循环。Modic改变（MC）是临床上常见的一种终板退变形式,有研究表明IL-1β和TNF-α等炎症子在Modic改变（MC）中激活。近年来,间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）因其强大的增殖、分化潜力及免疫调节功能在椎间盘退变的治疗中备受关注。但是MSCs容易衰老、易成瘤及在恶劣环境下难以存活等问题极大的限制了它的应用。最近的研究表明MSCs能通过旁分泌的方式对靶细胞产生多种功能效应,外泌体（Exosomes）在其中发挥重要作用。目前间充质干细胞来源的外泌体（Exosomes derived from mesenchymal stem cells,MSC-Exos）对椎间盘的治疗作用的研究取得了可喜的成就。多项研究报告MSC-Exos能通过不同的方式减轻髓核细胞的损伤。但是MSC-Exos对退变终板软骨细胞的研究较少,仅一项研究报道了骨髓间充质干细胞来源的外泌体（Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells,BMSC-Exos）对叔丁基过氧化氢（TBHP）诱导的氧化应激模型下退变终板软骨细胞的作用。而终板退变已经被证明与IL-1β等炎症因子有关。本次研究中我们利用IL-1β刺激人终板软骨细胞炎症模型,初步探究人骨髓间充质干细胞（human marrow mesenchymal stem cells,hMMSCs）来源的外泌体对IL-1β模拟的炎症环境下椎间盘终板软骨细胞的保护作用及发挥作用的下游机制。研究方法:1.原代hMMSCs的分离、鉴定和扩增:利用BMSCs塑料粘附性的特性获取原代hMMSCs。通过流式细胞术鉴定MSCs主要的表面分子标记物。用hMMSCs专用无血清培养基对hMMSCs进行培养及传代扩增。2.骨髓间充质干细胞来源外泌体（Exosomes derived from human marrow mesenchymal stem cells,hMMSC-Exos）的提取、纯化及鉴定:收集第三代到第五代BMSCs细胞培养上清液,利用尺寸排阻色谱法进行外泌体的分离和提纯。纳米粒径示踪分析仪（Zeta View）检测细胞外囊泡的数量和粒径,透射电镜检测外泌体的形态,western blot鉴定其表面分子标记物。3.终板软骨细胞的分离及培养:收集腰椎开放手术中刮除的软骨终板,利用胰酶及II型胶原酶消化的方式分离终板软骨细胞,通过甲苯胺蓝和番红O染色对其进行鉴定。用DMEM-F12完全培养基对终板软骨细胞进行培养和传代。4.用CCK8实验检测IL-1β（10ng/ml）干预下不同浓度（0ug-50ug/ml）外泌体对终板软骨细胞增殖能力的作用,并且寻找合适浓度的Exosomes进行后续的干预实验。5.根据干预措施将终板软骨细胞分成三组:（1）对照组（2）IL-1β干预组（3）IL-1β+外泌体干预组。Hochest荧光染色检测三种干预措施下凋亡终板软骨细胞,流式细胞术检测三种干预措施下终板软骨细胞凋亡率。蛋白印迹实验（Western blot,WB）检测细胞凋亡蛋白Bax、Bad、Caspase3变化情况。RT-q PCR检测炎症因子Cox2、IL-6、TNF-α的m RNA表达量。6.在外泌体干预的前提下,增加AKT抑制剂MK-2206,探究外泌体是否通过AKTmTOR信号通路来抑制IL-1β环境下终板软骨细胞的凋亡。根据干预措施将终板软骨细胞分成四组:（1）对照组（2）IL-1干预组（3）IL-1β+外泌体干预组（4）IL-1β+外泌体+MK-2206干预组。Western blot检测四种干预条件下AKT-mTOR信号通路蛋白p-AKT、p-mTOR、Beclin1、LC3II、LC3I的变化情况,流式细胞术检测四种不同措施下终板软骨细胞的凋亡率。结果:1.获取的贴壁骨髓细胞在镜下主要呈长梭形,可聚集成团块或漩涡状。流式细胞仪鉴定出MSCs的主要分子标记物CD73、CD90,并且不表达CD34。2.纳米粒径跟踪（NTA）技术测出提取的囊泡平均直径为123.3nm,透射电镜下可见外泌体特征性的内部凹陷构象,WB检测出外泌体的分子标记物CD9、CD63。3.胰蛋白酶和II型胶原酶消化的方法获取的贴壁细胞在镜下主要呈三角型,部分呈梭形,甲苯胺蓝染色呈蓝紫色,番红0染色呈红色。4.CCK8结果表明随着外泌体浓度的升高,平均光密度（OD）值升高,当外泌体浓度为30ug/ml时平均OD值最大。5.IL-1β组较对照组终板软骨细胞凋亡细胞数及凋亡率明显上升;L-1β+外泌体组较IL-1β组终板软骨凋亡细胞数及细胞凋亡率下降。IL-1β组相对于对照组终板软骨细胞凋亡蛋白Bax、Bad、caspase3的表达量及炎症因子COX2、IL-6、TNF-α的m RNA表达量显著上调;L-1β+外泌体组相对于IL-1β组终板软骨细胞凋亡蛋白Bax、Bad、caspase3的表达水平及炎症因子COX2、IL-6、TNF-α的m RNA表达水平显著下调。6.IL-1β组p-AKT、p-mTOR蛋白表达水平下降,自噬相关蛋白Beclin1表达水平及LC3II/LC3I比值升高。IL-β组+外泌体组相对于IL-1β组p-AKT和p-mTOR表达量上升,Beclin1表达量及LC3II/LC3I比值下降。IL-β组+外泌体+MK-2206组相对于IL-β+外泌体组,p-AKT和p-mTOR表达量下降,Beclin1表达水平及LC3II/LC3I比值上升,终板软骨细胞凋亡率增加。结论:来源于骨髓间充质干细胞的外泌体能促进终板软骨细胞的增殖,并且减轻IL-1β诱导的终板软骨细胞凋亡和炎症,能保护终板软骨细胞。BMSC-Exos可激活AKTmTOR通路来减轻IL-β诱导的终板软骨细胞自噬和凋亡。