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目的激素性股骨头坏死(osteonecrosis of the femoral head, ONFH)是骨科的常见病和疑难病。目前激素性ONFH的临床治疗进展缓慢,往往出现坏死才进行治疗,严重影响了患者的工作和生活质量,由于其发病机制尚不清楚,现仍没有有效的预防措施,最终大多需行人工全髋关节置换。因此,干预、阻断使用激素导致的ONFH进展,对其发病机制和防治技术进行研究,具有重要的意义。本实验中,建立激素性股骨头坏死动物模型,应用六味地黄丸干预,探讨六味地黄丸预防ONFH的可行性及分子机制,为临床激素必需性应用所致ONFH的预防提供实验依据。方法取成年健康昆明小鼠36只,体重40～50 g,平均46g,随机分为3组(n=12)。三组动物体重和雌雄数经t检验差异无统计学意义(P>0.05)。空白对照组(A组),马血清+激素组(B组),马血清+激素+六味地黄丸组(C组); B、C组小鼠按10 mL/kg腹腔注射马血清,间隔2周后按5 mL/kg再次腹腔注射马血清,第二次注射马血清同时肌肉注射醋酸泼尼松龙45 mL/(kg·d),共5 d,制备激素性ONFH小鼠模型,于应用激素同时B组灌服生理盐水10 mL/(kg·d),C组灌服六味地黄丸2 g/(kg·d)至处死;A组小鼠不制备模型,同时间点肌肉注射及灌服等量生理盐水。处理后观察小鼠一般情况,于第1次激素注射后2、4、8周处死小鼠,大体观察股骨头,取双侧股骨头及肝脏行组织学及免疫组织化学染色观察,TUNEL法检测骨细胞凋亡情况。统计学分析采用SPSS13.0软件包进行分析。数据以均数±标准差表示,组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK检验,P值< 0.05为有统计学意义。结果一般情况及大体观察:第一次腹腔注射马血清后所有小鼠均无明显变化;第二次腹腔注射马血清后约6小时,B、C组小鼠出现食量减少、萎靡、反应迟钝、活动少等现象,C组小鼠约1周后逐步好转,B组小鼠约2周后逐步好转,A组小鼠无明显变化。B组小鼠于第二次腹腔注射马血清后7d、11d各死亡一只,C组小鼠于第二次腹腔注射马血清后10min死亡一只,余小鼠均存活至实验完成。3组动物各时间点股骨头外观形态均正常,关节软骨面均光滑、平整,色泽无异常。HE染色观察:A组各时间点肝脏均正常;股骨头骨小梁粗大、完整,排列规则,骨细胞清晰可见,偶见空骨陷窝,髓间脂肪细胞相对较少,形态正常,造血细胞丰富。B组第1次激素注射后2周时肝细胞肿胀,细胞内可见小脂肪空泡,肝索结构不清,肝窦变窄;第1次激素注射后2周时见骨小梁较正常变细,部分断裂,骨细胞空骨陷窝增多,部分骨细胞边聚、固缩,髓间脂肪细胞直径增大,数目增多;4、8周时骨小梁变细、稀疏,断裂处增加,可见骨碎片出现,空骨陷窝率增高。C组肝脏及股骨头各时间点较A组变化不显著。B组空骨陷窝率明显高于A、C组(P <0.01),A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。免疫组织化学染色观察:A组各时间点骨保护素(osteoprotegerin ,OPG)棕黄色颗粒多见、骨保护素配体(osteoprotegerin ligand, OPGL)棕黄色颗粒较少,阳性染色率无明显改变;B组第1次激素注射后2周,OPG阳性表达棕黄色颗粒偶见,OPGL阳性表达棕黄色颗粒较多,第4、8周时,阳性率降低和升高有增加趋势;C组各时间点OPG棕黄色颗粒多见、OPGL棕黄色颗粒较少,随时间延长,阳性染色率稍升高和降低,C组各时间点OPG、OPGL蛋白表达较A组稍降低和升高。各时间点B组与A、C组比较,股骨头OPG局部表达明显下降,OPGL局部表达明显上升,差异均有统计学意义(P<0.01),A、C组间OPG阳性表达水平第2周时差异有统计学意义(P < 0.05),第4、8周时差异无统计学意义(P > 0.05);A、C组间OPGL阳性表达水平第2、4周比较差异有统计学意义(P < 0.05),第8周差异无统计学意义(P > 0.05)。细胞凋亡分析显示:B组各时间点均可见细胞核中出现较多棕黄色颗粒的阳性细胞,其凋亡指数(apoptosis index,AI)随时间延长增大;A、C组各时间点阳性细胞偶见,细胞AI无明显改变。B组较A、C组骨细胞凋亡指数显著升高,差异有统计学意义(P <0.01)。结论:1.六味地黄丸对激素应用导致的肝脏脂质代谢紊乱具有明显的预防作用。2.六味地黄丸具有改善骨代谢、保护骨细胞的作用,可通过抑制激素对成骨细胞活性的影响,阻止骨吸收,促进骨形成和骨修复。3.六味地黄丸可以拮抗激素对OPG和OPGL蛋白表达的影响,从而促进成骨细胞增殖,降低并抑制破骨细胞的活性,有效改善了骨代谢,改善了骨骼生物力学状态。4.应用激素可导致骨细胞凋亡明显增加,六味地黄丸可显著减少激素应用所致骨细胞凋亡,保护骨细胞。综上所述:六味地黄丸具有改善骨代谢、保护骨细胞、降脂等作用,可通过抑制股骨头局部骨细胞凋亡、拮抗激素对股骨头内OPG/OPGL表达的影响,从而起到预防早期激素性股骨头坏死的作用。