基于Capture-SELEX的三种兽药残留适配体的筛选及应用研究

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兽药通过食物链进入人体并在体内蓄积,可引发多种毒性危害,损伤肝脏、肾脏等器官,损伤消化、神经、血液循环等系统,影响人体正常生理功能。适配体是一类能特异性结合靶标的新型识别分子,其具有和抗体相似的亲和力和特异性,且具有靶分子范围广、便于修饰、易于合成等优点,随着兽药适配体陆续被筛选获得,其在兽药残留检测领域中的应用也愈加广泛。本研究通过Capture-SELEX技术首次筛选得到了左旋咪唑、甲氧苄啶、常山酮的特异性适配体,并基于所得适配体结合比色/表面增强拉曼散射(Surface-enhanced raman scattering,SERS)/荧光法构建了食品中左旋咪唑、甲氧苄啶、常山酮的检测方法。首先,通过Capture-SELEX技术筛选左旋咪唑、甲氧苄啶、常山酮的适配体。筛选以文库固定,靶标孵育,聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增和单链制备为一个循环,并使用荧光法对筛选进程进行了监控。对富集率达到饱和时的循环产物进行高通量测序,选择测序结果中丰度最高的前5条序列作为候选适配体。采用SYBR Green I(SGI)染料检测法和等温滴定量热法(Isothermal titration calorimetry,ITC)考察了候选适配体的亲和力和特异性,其中LEV-5、TMP-1、HAL-4分别对左旋咪唑、甲氧苄啶、常山酮表现出较好的亲和力和特异性,解离常数(Kd)分别为66.15±11.86 n M、48.86±5.807 n M、96.74±11.22 n M。采用圆二色谱(Circular dichroism,CD)探究了适配体与靶标结合前后的构象变化,包括245 nm处脱氧核糖核苷酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)的螺旋性增强和275 nm碱基堆积作用增强。进一步采用分子模拟对接分析了适配体与靶标结合的结合机理,结果表明适配体主要通过疏水作用力、范德华力和氢键与靶标实现非共价结合。其次,构建基于比色和SERS双模式的适配体传感检测牛奶中左旋咪唑的方法。以适配体修饰的磁性纳米材料为捕获探针,以修饰有适配体互补链的具有类过氧化物酶活性和SERS效应的AuNPs/Cu-TCPP(Fe)纳米片作为信号探针,利用比色和SERS双检测模式实现了对左旋咪唑的检测。两种模式的检测限(Limit of detection,LOD)分别为5 n M和1.12 n M。该比色-SERS双模式适配体传感方法较单一比色法或单一SRES检测方法具有更高灵敏度和更直观的检测性能,能适应更多的实际应用场景。该方法可应用于牛奶中左旋咪唑的检测,回收率为94.95%~111.2%。再次,构建基于互补链竞争显色法的适配体传感检测牛奶中甲氧苄啶的方法。以固定于微孔板表面的适配体为捕获探针,以辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase,HRP)修饰的适配体互补链为信号探针,利用HRP氧化TMB底物变色的特性,实现对甲氧苄啶的检测。该方法在0.1μM~12μM的靶标浓度范围内与吸光度呈良好线性关系,检测限为0.1μM。可成功应用于牛奶样品中甲氧苄啶的测定,回收率为85.5%~112.0%。最后,构建基于荧光法的适配体传感检测鸡蛋中常山酮的方法。以固定于磁珠表面的生物素修饰的适配体互补链为捕获探针,以FAM修饰的适配体为信号探针,利用加入靶标后上清液中信号探针的荧光强度的变化,实现了对常山酮的检测。该方法在0.1μM~50μM的靶标浓度范围与荧光强度呈线性关系,检测限为0.13μM。可成功应用于鸡蛋样品中常山酮的测定,回收率为87.40%~109.9%。
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