绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)是引起绵羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenocarcinoma,OPA)的病原,该病是绵羊肺分泌上皮细胞发生恶性转化的一种传染性肺癌。研究表明JSRV-env可作为致癌基因,单独的JSRV Env蛋白可以转化小鼠NIH3T3细胞,大鼠208F细胞,鸡成纤维细胞和犬上皮细胞,并且可以在小鼠和绵羊中诱导肺癌,因此,JSRV的囊膜蛋白(Env)具有引起细胞转化而致癌的罕见特征,但Env的致癌作用机制仍未解析清楚。在哺乳动物中,m TOR(哺乳动物雷帕霉素靶标)蛋白激酶是营养素和生长因子信号传导的中心节点。最广泛的肿瘤抑制蛋白是p53,并且p53在感受遗传毒性和其他应激中起关键作用。但是仍很少有关于p53/AMPK/mTOR信号通路与OPA肿瘤的发展过程,以及JSRV Env诱导细胞转化之间关系的深入研究。为进一步探讨绵羊肺腺瘤逆转录病毒囊膜蛋白的功能,本研究将本实验室保存的真核表达质粒pEGFP-C1/exJSRV-env和pEGFP-C1/en JSRV-env,瞬时转染到绵羊绒毛膜滋养层细胞,48 h后通过荧光显微镜观察,结果表明,2.5μg的真核表达质粒中加入10μL LTX为最佳转染条件。应用软琼脂集落形成实验对转染真核表达质粒p EGFP-C1/ex JSRV-env和pEGFP-C1/enJSRV-env以及pEGFP-C1空质粒的绵羊绒毛膜滋养层细胞检测是否引起恶性转化,结果表明,转染p EGFP-C1/ex JSRV-env质粒后细胞在软琼脂中生长并产生集落,同时表现细胞接触抑制性消失;转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒、p EGFP-C1空质粒以及空白对照组细胞则表现为不能在软琼脂中产生集落。应用平板克隆实验检测囊膜蛋白的表达对细胞增殖的影响,结果显示转染pEGFP-C1/exJSRV-env的绵羊绒毛膜滋养层细胞的克隆形成率显著高于转染pEGFP-C1/enJSRV-env细胞、pEGFP-C1空载体的细胞以及未转染的细胞(P<0.01)。采集绵羊自然感染OPA的病肺组织,并且将健康绵羊肺组织作为对照,提取总蛋白后采用Western blot法检测p53/AMPK/mTOR信号通路在OPA病肺组织中的蛋白表达量,结果表明,p53、p-mTOR在OPA中的磷酸化水平极显著高于健康肺组织,而p-AMPK在OPA中的磷酸化水平极显著低于健康肺组织。应用Western blot法检测p53/AMPK/mTOR信号通路在JSRV Env转化的绵羊绒毛膜滋养层细胞中的蛋白表达量,结果显示,p53、p-mTOR在JSRV Env转化的绵羊绒毛膜滋养层细胞中的磷酸化水平显著高于对照组细胞,p-AMPK在绵羊绒毛膜滋养层细胞的磷酸化水平显著低于对照组细胞。本研究表明exJSRV Env的表达可以诱导绵羊绒毛膜滋养层细胞发生恶性转化以及细胞增殖;以及对p53/AMPK/mTOR信号通路做出了初步研究。为进一步探讨绵羊肺腺瘤逆转录病毒囊膜蛋白的功能提供理论依据,并为研究绵羊肺腺瘤病的致瘤机制提供新思路。