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研究背景:创伤后应激障碍（Post-traumatic stress disorder,PTSD）是个体经历急性、创伤性应激事件后即刻或延迟出现的长期精神障碍性疾病,该疾病包含一系列症状,如惊恐与焦虑,抑郁,认知与社交功能障碍,物质滥用,自杀倾向等。研究提示,PTSD的终生流行率分布在1.3%到12.2%之间。PTSD的发病机制复杂多样且至今尚未阐明,有遗传因素、早年应激经历、下丘脑-垂体-肾上腺（Hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA）轴功能紊乱、神经内分泌因素等。其中早年应激经历增加PTSD的发病风险。早年应激是指在个体生命早期（如幼儿期或青少年期）所经历的各种负性生理或心理事件及其反应。青少年期处于生长发育的重要时期,此阶段经历应激会对其情绪和认知相关脑区的结构和功能产生持久性影响,从而导致学习和记忆功能、情绪调节和社交行为障碍,但其具体的机制尚不十分清楚。脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）在神经元的生长,发育和分化起重要作用,可抑制因受损伤导致的神经元死亡、可使神经元病理状态得到改善,可促进神经元再生和分化等,BDNF表达水平降低影响海马神经再生和突触可塑性。BDNF异常是诸多精神障碍如精神分裂症,抑郁症和创伤后应激障碍等发病机制中的重要环节。近年来,表观遗传机制在环境因素如应激导致的PTSD发病易感性中的作用受到重视。研究表明,母婴分离、社会隔离和慢性不可预知应激均导致表观遗传因子H3K9me2/3发生不可逆改变,而H3K9me2/3对Bdnf基因表达具有负调节作用。这提示应激所致的表观遗传修饰是引发行为改变的分子生物学机制。但青少年期创伤性应激是否引起表观遗传标记修饰变化,这些变化通过何种机制导致短期和长期的行为改变,尚不十分清楚。本研究采用创伤后应激障碍的动物模型,考察青少年期的创伤性应激对表观遗传修饰标记H3K9me2和BDNF的短期（青少年期,21日龄）和长期（成年期,63日龄）影响,阐明表观遗传修饰标志H3K9me2在创伤性应激事件后的修饰水平,及其是否参与调控Bdnf基因表达,从而影响BDNF mRNA及BDNF蛋白表达水平和神经元树突发育。研究目的:（1）青少年期创伤性应激对大鼠焦虑抑郁样行为,认知功能,社会探索功能的短期和长期影响。（2）青少年期创伤性应激对大鼠海马、前额叶、杏仁核神经元树突生长发育以及H3K9me2修饰水平,BDNF mRNA和BDNF蛋白表达水平的短期和长期影响。材料和方法:（1）实验动物与分组雄性Wistar大鼠72只,21日龄。本研究共包括6组动物:青少年期对照组,青少年期PTSD组,青少年期PTSD+Unc642组,成年期对照组,成年期PTSD组,成年期PTSD+Unc0642 组。（2）单一连续足掌电击（Inescapable foot shock,IFS Procedure）（3）Unc0642腹腔注射于最后一次电击结束后30 min腹腔注射,剂量为2.5 mg/kg/d。（4）行为学测试采用旷场实验（Open field test,OFT）、高架十字迷宫实验（Elevated plus maze test,EPT）、三箱社交实验（Three-chamber sociability test,SIT）和 Morris 水迷宫实验（Morris water maze,MWM）。（5）高尔基染色整个脑经过染色、脱水处理后,冰冻切片10 um,甘油明胶直接封片,分别拍摄200×完整神经元视野和1000×油镜下清晰的树突。采用Image J 6.0软件中Sholl analysis插件,在200×视野进行总交点数计算,即树突长度及分支情况的分析。在1000×视野进行树突棘数量和密度的计算。（6）免疫印迹每组分别取前额叶、海马和杏仁核组织裂解、研磨和清液分装。BCA测定蛋白浓度。进行上样,跑胶,显影,条带灰度值分析使用Im age J。（7）实时荧光定量PCR每组分别取20 mg组织放于2 ml EP管中,加入500 ml Trizol和小钢珠2枚,放入预冷的研磨仪研碎使组织无碎块,继续加入500 ml Trizol以及200 ml氯仿,摇匀至液体呈现乳白色,室温静置5 min以充分裂解提取RNA,离心取上清400 uL至新的离心管,加入同样体积（400 uL）的异丙醇,放于-80℃保存或继续75%无水乙醇（DEPC水配制）洗沉淀以得到RNA,并使用分光光度仪进行RNA浓度测量,根据500 ng的总量反转录cDNA,使用CFX-BIO上机。目的基因的相对表达量使用2-ΔΔCT法进行计算。（8）染色质免疫共沉淀（ChIP-qPCR）染色质共沉淀实验在处死大鼠后的1周内进行,每组取60-75 mg组织手动剪成1-2 mm大小的组织碎块,加入ChIP细胞裂解液（ChIP cell lysis buffer）后手动研磨成单细胞悬液;加入ChIP Nuclearlysis Buffer后进行超声裂解,得到的理想染色质片段为150-1000 bp。之后进行IP反应,磁珠和抗体过夜处理后,解交联,使用DNA纯化试剂盒得到纯化的DNA,进行ChIP-qPCR,计算富集率。此技术旨在进一步证明H3K9me2和Bdnf基因启动子之间的关系,从而明确H3K9me2将直接负调控Bdnf基因的转录过程。研究结果:（1）青少年期创伤性应激导致大鼠焦虑、抑郁样行为,社会探索以及认知功能下降,且这些异常行为可以持续到成年期。应用组蛋白甲基转移酶小分子抑制剂Unc0642可缓解上述行为异常。（2）青少年期创伤性应激导致大鼠海马、前额叶和杏仁核神经元树突生长发育异常。应用组蛋白甲基转移酶小分子抑制剂Unc0642可改善青少年期海马和前额叶的神经元树突生长发育情况,但对于成年期的神经元树突发育无明显改善作用。Unc0642对青少年期和成年期杏仁核脑区的神经元树突生长发育均有改善作用。（3）青少年期创伤性应激导致短期和长期的大鼠海马、前额叶和杏仁核脑区H3K9me2修饰水平升高,BDNF mRNA和BDNF蛋白表达水平降低。组蛋白甲基转移酶的小分子抑制剂Unc0642可改善各脑区相应的分子生物学指标。研究结论:青少年期创伤性应激通过表观遗传因子H3K9me2调控其下游Bdnf基因启动子序列从而沉默基因表达,导致海马、前额叶和杏仁核脑区BDNF mRNA和BDNF蛋白表达水平显著降低、神经元树突发育异常,焦虑抑郁样行为,社会交往和探索能力以及空间记忆的障碍。以上生物学分子层面和神经元树突发育异常的改变是青少年创伤性应激经历（早年应激经历）提高创伤后应激障碍易感性的机制。