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第一部分研究背景:血小板在止血中发挥重要作用,整合素αⅡbβ3是血小板表面表达最丰富且是信号转导的最终路径,αⅡbβ3信号转导包括内向外信号（代表性事件为纤维蛋白原结合）和外向内信号传导（代表性事件为伸展、聚集、释放、血块收缩）。然而同为外向内信号转导的事件伸展聚集和血块收缩具体由什么分子机制介导目前尚不清楚。既往我们发现含αⅡbβ3E726Q突变的CHO细胞伸展受限,但在血小板的情况不明。Rac1调节板状足突和膜皱褶的形成,Cdc42触发细胞周围的丝足延长,RhoA调节应力纤维的形成,他们共同促进细胞骨架重排、细胞形态和运动的调节等,提示β3E726Q基因突变可能通过影响RhoA、Rac1和Cdc42通路进而影响血小板伸展与血块收缩过程。研究目的:本研究拟通过β3E726Q突变鼠血小板探索外向内信号转导的事件伸展聚集和血块收缩内在的分子机制,为出凝血疾病的诊治提供理论基础。研究方法:（1）繁殖并鉴定整合素β3E726Q转基因小鼠,用PE hamster anti-mouse CD61抗体流式细胞仪检测β3E726Q转基因小鼠血小板表面整合素β3表达,Western blot检测血小板中β3蛋白的表达,细胞计数仪测定β3E726Q转基因小鼠的血细胞。（2）在荧光显微镜下及电子显微镜下观察β3E726Q转基因小鼠血小板在固相化纤维蛋白原上的伸展;用血小板聚集仪检测β3E726Q转基因小鼠血小板在ADP、胶原或凝血酶刺激下的聚集;流式细胞仪检测凝血酶刺激后的β3E726Q转基因小鼠血小板表面的P-选择素的表达;血栓弹力图检测β3E726Q转基因小鼠血栓形成。（3）检测断尾后β3E726Q转基因小鼠出血时间及出血量;利用高清晰共聚焦显微镜结合生物发光系统观察体内实时提睾肌动脉内血栓形。（4）以凝血酶为诱导剂,检测β3E726Q转基因小鼠血块收缩能力,并通过共聚焦显微镜观察不同小鼠血栓收缩情况。（5）Co-IP检测β3E726Q转基因小鼠血小板中β3E726Q与Talin、Gα13的相互作用情况,并与WT小鼠血小板对比。检测β3E726Q血小板在激动剂刺激前/后不同时间点RhoA、Rac1、Cdc42、c-Src的激活程度,并与WT小鼠血小板对比。以上实验,β3-/-和WT小鼠将作为对照。研究结果:（1）成功建立β3E726Q转基因小鼠并鉴定出纯合子,该小鼠与WT小鼠相比,其血小板表面整合素β3表达无明显差异,血小板数量、血红蛋白水平也无差异;（2）β3E726Q转基因小鼠与WT小鼠相比血小板伸展功能、聚集功能、P-选择素表达下降;（3）β3E726Q转基因小鼠与WT小鼠相比断尾后出血时间延长、出血量增加,体内提睾肌动脉血栓形成受抑。（4）β3E726Q突变鼠与WT小鼠相比其血小板血块收缩能力增强,在凝血酶刺激后20 min时最为明显。研究结论:与WT小鼠相比,β3E726Q转基因小鼠血小板伸展功能、聚集功能、释放功能（P-选择素表达）下降,出血时间延长,体内血栓形成受抑;但是血块收缩功能增强;内在的机制需要进一步探索,可能涉及到Talin、Gα13、RhoA、Rac1、Cdc42、c-Src等。第二部分研究背景:血栓性疾病严重影响人类健康,现有的抗栓药在抗栓的同时存在出血风险,靶向信号通路中的关键分子是新的抗血栓策略,可以做到抗栓而不出血。血小板参与血栓形成,这一过程中整合素αⅡbβ3发挥着关键作用。整合素αⅡbβ3的激活依赖于细胞内Talin和Kindlin-3与β3胞质尾部的相互作用,Kindlin-3敲除的小鼠尽管有正常的Talin,整合素αⅡbβ3仍然不能被激活,同时Kindlin也参与整合素的集簇形成。在哺乳动物中,Kindlin包括三个家族成员:Kindlin-1、Kindlin-2、Kindlin-3,三个家族成员之间有高度序列同源性。我们前期在CHO细胞模型中发现截去PH结构域的Kindlin-3可部分抑制血小板的活化,而PH结构域中的5个氨基酸残基R360R362K363K367R370是主要作用位点。但具体哪些是关键位点不明,在血小板血栓形成中的作用如何,是否可以作为抗血栓靶点,尚不清楚。研究目的:本研究中涉及Kindlin-3多个位点的突变,如果使用受精卵基因重组的方法获得转基因小鼠耗时耗力,故本项目拟通过将被编码Kindlin-3不同突变体（APH、R360R362/AA、R362K363/AA、K367/A、K367R370/AA或R360R362K363K367R370/AAAAA）的慢病毒感染Kindlin-3缺陷的骨髓造血干细胞,将其移植到化疗药预处理的Kindlin-3缺陷小鼠体内,从而建立骨髓移植转基因小鼠,检测其血小板的功能,筛选出关键位点,为新型抗血栓药物研究提供理论基础。研究方法:（1）繁殖并鉴定出Kindlin-3flox/floxMx-1 Cre小鼠。（2）通过腹腔注射Poly（I:C）诱导Cre酶表达,选择性敲除Kindlin-3基因。（3）提取血小板蛋白通过Western blot方法检测Kindlin-3基因是否敲除。（4）摸索适宜的预处理化疗方案,建立骨髓移植小鼠模型。（5）建立血液系统表达不同突变的 EGFP-Kindlin-3（APH、R360R362/AA、R362K363/AA、K367/A、K367R370/AA 或 R360R362K363K367R370/AAAAA）骨髓移植转基因小鼠。检测这些小鼠血小板功能及胞内信号相互作用机制,筛选出特定的关键位点。研究结果:（1）成功鉴定并繁殖一批Kindlin-3flox/flox Mx-1Cre小鼠。（2）通过腹腔注射Poly（I:C）,成功敲除Kindlin-3基因,获得一批Kindlin-3-/-小鼠。（3）摸索出适宜的化疗方案BU 30 mg/kg（d1-d4）+CY 200 mg/kg（d5-d6）,初步建立了小鼠骨髓移植模型。研究结论:通过腹腔注射Poly（I:C）选择性敲除了 Kindlin-3基因。发现在BU 30mg/kg（d1-d4）+CY 200 mg/kg（d5-d6）剂量下小鼠能够获得较好的清髓效果,同时能够移植成功。