论文部分内容阅读
目的:随着生活节奏的加快,人们饮食结构的改变,代谢性疾病已经成为全球范围的严峻话题。因此,深入探讨食物摄入和胃肠功能的调节机制将有助于我们寻找靶点,更有效地治疗代谢性疾病。已有的研究显示,钙离子敏感受体(calcium sensing receptor,CaSR)在胃肠道粘膜层和肌间神经丛有丰富表达,通过影响激素分泌和神经递质表达参与摄食和胃肠运动调节。后期的研究发现CaSR在中枢下丘脑和边缘系统等摄食相关脑区也有表达,但中枢CaSR参与摄食和胃肠运动调控的机制尚未报道。因此,本研究旨在探讨杏仁基底外侧核(basolateral amygdala,BLA)CaSR在摄食及胃肠运动中的调节作用及潜在机制。方法:1.采用摄食分析法,观察小鼠BLA微量注射CaSR激动剂R568对摄食量的影响;2.采用旷场、高架十字迷宫、强迫游泳、悬尾及蔗糖偏爱实验,观察BLA微量注射R568对小鼠焦虑抑郁样行为的影响;3.采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)观察 BLA微量注射R568对BLA神经肽胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)、神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)、神经递质谷氨酸(glutamate,Glu)及 γ-氨基丁酸(gamma-a minobutyric acid,GAB A)含量的影响;4.采用荧光免疫组织化学染色,观察BLA CaSR/NPY或CaSR/囊泡谷氨酸转运蛋白 1(vesicular glutamate transporter 1,VGLUT1)的共表达;5.采用荧光免疫组织化学染色,观察BLA微量注射R568,下丘脑室旁核(paraventricular nucleus,PVN),外侧区(lateral hypothalamus,LHA),弓状核(arcuate nucleus,ARC)c-Fos免疫阳性神经元的表达;6.采用ELISA方法,观察BLA微量注射R568,下丘脑胃饥饿素(ghrelin)、食欲素(orexin)、CCK、nesfatin-1、五羟色胺(Serotonin,5-HT)和多巴胺(dopamine,DA)含量的影响;7.采用ELISA方法,观察BLA微量注射R568,中脑腹侧被盖区(ventral tegmental area,VTA)DA和中缝背核(dorsal raphe nucleus,DRN)5-HT 含量的影响;8.采用ELISA方法,观察ARC或VTA微量注射Glu受体阻断剂,BLAR568对下丘脑或VTADA含量的影响;9.采用摄食分析法,观察小鼠BLA微量注射R568对可口食物摄入量的影响;10.采用荧光免疫组织化学染色,观察ARC强啡肽(Dynorphin)/c-Fos或VTA GABA/c-Fos的共表达情况;11.采用单细胞细胞外放电技术,观察R568对BLA葡萄糖敏感神经元(glucose sensitive neuros,GSN)放电频率的影响;12.采用酚红排泄实验及炭末小肠推进方法,观察BLA微量注射R568对胃排空和小肠推进率的影响。结果:1.摄食结果显示,与DMSO组相比,BLA微量注射R568,小鼠对普通饲料0-1 h,1-2h的摄入量显著降低(P<0.05),但2-4h,4-24h摄食量无明显差异(P<0.05);小鼠对可口食物0-2 h摄入量显著降低(P<0.05),而2-4 h,4-24 h的摄食量无明显差异(P>0.05)。2.行为学研究结果显示,与DMSO组相比,R568组小鼠在旷场中央运动距离,中央格停留时间显著减少(P<0.05),进入高架十字迷宫开放臂的次数和滞留时间明显减少(P<0.05);在强迫游泳和悬尾实验中小鼠不动时间显著增加(P<0.05);蔗糖偏爱实验中小鼠0-2 h的蔗糖偏爱百分比显著降低(P<0.05)。3.ELISA结果显示,与DMSO组相比,微量注射R568后,BLA中NPY显著减少(P<0.05),Glu显著增加(P<0.01),CCK和GABA含量无显著差异(P>0.05);下丘脑5-HT显著增多,DA显著减少(P<0.05),ghrelin,orexin,CCK,nesfatin-1的含量无明显差异(P>0.05);VTA中DA显著减少(P<0.05),DRN中5-HT无明显差异(P>0.05);而ARC和VTA微量注射Glu NMDA离子型受体阻断剂MK-801可阻断BLA微量注射R568对DA含量的作用(P<0.05)。4.荧光免疫组织化学结果显示,在BLA中存在CaSR/NPY或CaSR/VGLUT1免疫阳性神经元的共表达,与DMSO组相比,BLA微量注射R568后PVN,LHA,ARC的c-Fos明显增多,ARC的Dynorphin神经元以及VTA的GABA神经元与c-Fos共染免疫阳性神经元显著增多(P<0.05)。5.电生理结果显示,BLA微量注射R568后,葡萄糖兴奋性神经元(GS-EXC)放电频率显著增高(P<0.05),葡萄糖抑制性神经元(GS-INH)放电频率明显降低(P<0.05)。6.胃肠动力实验结果显示,与对照组相比,BLA微量注射R568后,胃排空和小肠推进率无显著差异(P>0.05),但R568灌胃则可以明显抑制胃排空和小肠推进率(P<0.05);体外研究表明,R568可显著降低胃窦、空肠及回肠肌条的收缩幅度。(P<0.05)。结论:BLA微量注射R568可抑制小鼠0-2 h的摄食,R568对摄食的抑制作用可能与激活CaSR引起焦虑和抑郁样情绪,抑制BLA NPY的分泌,以及激活BLA Glu能神经元有关。BLA Glu神经元可能通过激活Dynorphin和GABA神经元,抑制ARC和VTADA的释放减少摄食,NMDA离子通道型受体参与该调控。同时R568增强葡萄糖兴奋性神经元放电活动,减弱葡萄糖抑制性神经元放电活动,提示R568可能通过葡萄糖敏感神经元参与摄食调控;BLA微量注射R568对胃肠动力无显著作用,但R568外周给药可明显降低胃肠动力,这提示R568有调节胃肠功能的作用,但BLA不是作用靶点。我们的研究可进一步完善能量代谢平衡理论,为临床治疗能量代谢紊乱相关疾病提供研究基础。