甘露醇是一种重要的六碳糖醇,具有甜度适宜、热量低、不易吸潮、无毒副作用等特点,广泛的应用于食品、医药、化工等领域。目前,国内外工业化生产甘露醇的方法有生物提取法、化学氢化法和电化学法等,但上述方法都存在不足之处。近年来的研究表明,自然界中很多微生物都可以合成甘露醇,利用微生物发酵生产甘露醇具有明显优势,其反应条件温和易于控制,没有副产物山梨醇的产生,成本低廉,绿色环保。明串珠菌是一类革兰氏阳性细菌,为美国FDA公认的GRAS菌,可以利用蔗糖和果糖等发酵生产甘露醇,因其具有生长条件易于控制,代谢途径简单,发酵周期短,可以分泌特异性蛋白等特点,是作为甘露醇生产菌株的优势选择。为进一步提高肠膜明串珠菌的甘露醇产量,解决发酵过程中由于胞内产物过量积累而导致底物利用能力不足的问题,本研究在肠膜明串珠菌染色体上敲入并表达了大肠杆菌多药物外排泵系统中的Acr B基因,该外排泵系统作用底物十分广泛,可以将多种药物、洗涤剂和染料等直接输送至胞外,Acr B是其中的药物转运子,对药物的外排输送有很重要的作用。为了探究Acr B基因的敲入对肠膜明串珠菌生产甘露醇的影响,本研究分别选择乙醛脱氢酶和葡聚糖蔗糖酶基因作为敲入位点,构建了Acr B基因表达盒单拷贝敲入和双拷贝敲入突变菌株。通过构建乙醛脱氢酶aldh基因同源重组载体,利用α-淀粉酶基因做突变筛选标记,将载体导入至受体菌,经过同源重组获得带有α-淀粉酶基因标记的突变菌株。在此突变菌的基础上,导入含外源基因Acr B的aldh同源重组载体,再次发生同源重组获得Acr B基因表达盒单拷贝敲入突变菌。在该单拷贝敲入突变菌的基础上,通过构建葡聚糖蔗糖酶dts基因同源重组载体,利用同样的方法,将Acr B基因表达盒敲入,获得双拷贝敲入突变菌株。原始菌株和突变菌株的发酵结果表明,Acr B基因的敲入提高了肠膜明串珠菌对发酵底物蔗糖的利用能力,最适底物浓度由原来的90g/L提高到了110g/L,Acr B基因表达盒双拷贝敲入突变菌蔗糖转化率达到了44.41%,甘露醇产量为48.85g/L,同原始菌甘露醇产量相比提高了74.8%。