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食物过敏是食物中某种成分(变应原或过敏原)刺激人体免疫系统产生一种异常的病理性免疫应答。八大类食物过敏原中牛乳过敏较为普遍,而β-乳球蛋白是牛乳主要的过敏原之一,由反刍动物乳腺上皮细胞合成,含量约占乳清蛋白总量的55%,人乳中则不含有。本文采用制备型反相高效液相色谱获得高纯度的牛乳过敏原β-乳球蛋白,对其进行辐照协同超声非热加工处理。通过光谱学方法表征不同加工处理后过敏原的结构特征,在此基础上,利用人外周血嗜碱性粒细胞KU812,建立体外细胞模型评估蛋白致敏性变化。文章关键的实验方法、现象结果及结论表述如下。1.建立制备型反相高效液相色谱仪(C18)分离纯化牛乳过敏原β-乳球蛋白的方法,小试实验仅用25 min,经SDS-PAGE鉴定,得到的β-乳球蛋白纯度达到98.2%,得率为32.25%。基于小试参数进行十倍放大的中试工艺设计,选取C18色谱柱(直径25 mm,长度250 mm),上样量100 mL,体积10 mg/mL,并完成设备的选型,绘制工艺流程图和设备流程图。2.牛乳过敏原β-乳球蛋白经超声(40KHz,300W,30min)和辐照(5 kGy)协同处理,分为四组:原蛋白组,辐照组;先超声后辐照组,先辐照后超声组。加工后蛋白发生不同程度的聚合,一级和空间结构均发生不同程度的改变。在蛋白聚合过程中,二级结构从无序转为有序状态,Trp19基团向Arg124运动,荧光强度被部分猝灭,疏水基团包埋,荧光强度降低。并且,加工蛋白三级结构也发生改变,二硫键Cys106-Cys119可能发生断裂,既增强了巯基含量又有利于蛋白聚合。间接竞争ELISA法测定加工β-乳球蛋白与IgG的结合,结果显示结合能力明显降低,蛋白的部分抗原决定簇被破坏,降低了蛋白抗原性。3.选取对数生长期KU812细胞(l.0×l06个/mL)进行体外细胞学评估实验,检测KU812细胞脱颗粒释放的生物活性介质:β-HEX、组胺、TNF-α、IL-6以及胞内Ca2+浓度变化。结果发现原蛋白组检测到的活性物质含量最高,外钙内流现象最明显。Western Blot法检测KU812细胞激发后信号通路的Lyn、Syk、NF-κB以及MAPK家族蛋白的表达情况,原蛋白组信号通路上游和下游的磷酸化蛋白含量都最高,而加工蛋白的磷酸化程度较低。上游信号通路的源头激酶Lyn、Syk被抑制可以进一步抑制下游通路蛋白,从而抑制整个信号通路的转导。转录因子NF-κB被抑制导致新合成的细胞因子TNF-α和IL-6含量降低。同时,检测到的信号蛋白证实牛乳过敏可以由IgE/FcεRI信号通路介导,且KU812细胞系适合用于牛乳过敏机制的检测。体外细胞学评估再一次证明辐照技术可以降低蛋白致敏性,由于超声处理温和,其作用效果不明显。