固定化近平滑假丝酵母细胞催化乙酰基三甲基硅烷不对称还原反应的研究

来源 :华南理工大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:cdwkevin
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有机硅化合物是一类含C-Si键的非天然化合物,其不仅在不对称合成及功能材料中有非常重要的作用,而且许多有机硅化合物还具有特殊的生物学活性,其作为药物,较其碳结构类似物具有更强的药效、更高的选择性和更低的毒性。“硅替代”是药物设计、改造的有效途径。目前,制备手性有机硅醇的方法主要有化学法和生物法两种。其中,化学法合成手性有机硅醇的条件甚为苛刻,而且需要使用昂贵的手性试剂才能确保物质的手性纯度,而生物合成法因具有高效性、高对映体选择性、反应条件温和及环境污染小等优点而日益受到有机化学家的青睐。生物法催化潜手性酮的不对称还原是制备对映体纯手性醇的首选方法。与离体酶相比,以全细胞为催化剂不仅能利用自身的代谢过程实现辅酶的原位再生,省去辅酶的添加,同时酶和辅酶都被保护在天然的细胞环境中,有利于保持其活性。因此,微生物细胞催化还原反应合成对映体纯有机硅醇具有重要的意义。迄今,国内外尚未见微生物细胞遵循反Prelog规则催化乙酰基三甲基硅烷(ATMS)不对称还原生成对映体纯(R)-1-三甲基硅乙醇{(R)-1-TMSE}的研究报道。另一方面,离子液作为绿色反应介质应用于生物催化与生物转化近年来已引起了人们广泛的关注。研究结果表明,许多酶和微生物细胞在含离子液介质中具有较高的活性、选择性及稳定性,故含离子液介质中的生物催化反应具有广阔的应用前景。   基于以上情况,本论文对比研究了不同介质中近平滑假丝酵母Candida parapsilosis CCTCC M203011细胞遵循反Prelog规则催化ATMS不对称还原生成对映体纯(R)-1-TMSE的反应过程,探讨离子液对该反应的影响规律,揭示含离子液介质中生物催化特性,并以此为基础,建立起可望取得自主知识产权、高效、高选择性合成对映体纯(R)-1-TMSE的生物催化反应体系。   在水单相体系中,对比研究了游离近平滑假丝酵母细胞和固定化近平滑假丝酵母细胞催化ATMS不对称还原反应过程,发现固定化于海藻酸钙的近平滑假丝酵母细胞催化该还原反应得到明显较高产率,且大大提高了细胞的稳定性。固定化细胞的大小对该反应有显著的影响。当固定化细胞直径≤1mm时,反应初速度明显较快。此外,几种反应条件对固定化近平滑假丝酵母细胞催化ATMS不对称还原反应表现出重要的影响。该反应最适振荡速度、pH值、反应温度、底物浓度分别是180 r/min、6.0、30℃、20 mmol/L;在此最适条件下,反应的初速度、最大产率及产物的e.e.值分别为11.4μmol/h、96.5%和99.9%以上。显然,最适底物浓度较低,这可归因于水单相体系中较严重的底物、产物抑制和逆反应。   为了进一步提高反应底物浓度和反应效率,本研究尝试采用相转移的方法,以期利用第二相对底物和产物的萃取作用,降低水相中底物和产物的浓度,从而减轻底物、产物抑制和逆反应。由于有机溶剂/缓冲液是常见的双相反应体系,为此,首先在不同有机溶剂与缓冲液组成的双相体系中进行固定化近平滑假丝酵母细胞催化ATMS不对称还原反应。不同有机溶剂对该反应的影响各异。在所研究的有机溶剂中,疏水性较强的正己烷为最适有机介质。在正己烷/缓冲液双相反应体系中,固定化近平滑假丝酵母细胞催化ATMS不对称还原反应的最适两相体积比、底物浓度、缓冲液pH值、反应温度和振荡速度分别为2/1(缓冲液/正己烷)、60 mmol/L、6.5、30℃和180 r/min;在上述最佳反应条件下,反应初速度、最大产率和产物e.e.值分别为20.2μmol/h、94.2%和>99.9%。与水单相体系相比,正己烷/缓冲液双相反应体系能显著提高该反应的最适底物浓度,但是有机溶剂对细胞有一定的毒性作用,导致了该反应的最大产率有所降低。   为解决上述问题,本文采用具有良好生物相容性的离子液替代有机溶剂。在所研究的疏水性离子液中,1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐(C4MIM·PF6)为该反应的最适萃取相。在C4MIM·PF6/缓冲液双相反应体系中,固定化近平滑假丝酵母细胞催化ATMS不对称还原反应的最适底物浓度、两相体积比、缓冲液pH值、反应温度和振荡速度分别为120 mmol/L、8/1(缓冲液/C4MIM·PF6)、6.0、30℃和180 r/min;在上述最佳反应条件下,反应初速度、最大产率和产物e.e.值分别为24.9μmol/h、97.1%和>99.9%。显然,C4MIM·PF6/缓冲液双相反应体系能大大提高了该反应的最适底物浓度、反应初速度及最大产率。   鉴于离子液能改善细胞膜透性,改变底物和产物在细胞内的浓度,本研究试图通过向反应体系中添加亲水性的咪唑类离子液,以期降低胞内的产物浓度,进一步提高反应效率。研究发现,亲水性离子液的种类对固定化近平滑假丝酵母细胞催化ATMS不对称还原反应有较大影响,特定阴阳离子间的匹配对固定化近平滑假丝酵母细胞发挥最佳催化效果至关重要。只有当C2OHMIM+和NO3-匹配时,近平滑假丝酵母细胞的催化活性最高。在所研究的8种亲水性离子液中,该反应在含1-羟乙基-3-甲基咪唑硝酸盐(C2OHMIM·NO3)混合反应体系中具有最快的反应初速度和最大的产率,产物的e.e.值也保持99.9%以上,故选择C2OHMIM·NO3为该反应混合体系中的最适亲水性离子液。在C2OHMIM·NO3——缓冲液混合反应体系中,固定化近平滑假丝酵母细胞催化ATMS不对称还原反应的最适离子液浓度、缓冲液pH值、反应温度、振荡速度和底物浓度分别为10%(v/v)、6.0、30℃和180 r/min、60 mmol/L;在上述最佳反应条件下,反应初速度、最大产率和产物e.e.值分别为83.8μmol/h、97.9%和>99.9%。   文中首次利用含离子液介质固定化近平滑假丝酵母细胞遵循反Prelog规则催化ATMS不对称还原反应,能高效、高选择性地合成对映体纯(R)-1-TMSE。本研究不仅有助于丰富对含离子液介质中微生物细胞催化反应的认识,还提供了一条制备对映体纯手性有机硅醇的行之有效的新途径。
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