寻常型银屑病皮肤中B7-H3的表达及其作用研究

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研究目的:本文旨在观察共刺激分子B7-H3在银屑病患者皮肤中的表达,并探讨其对疾病进程的影响。研究方法:①临床收集银屑病患者及正常皮肤标本,使用免疫组化法检测B7-H3的表达情况。②通过在HaCaT细胞中加入脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)诱导细胞过度增殖,HaCaT细胞无血清培养基饥饿处理12h后,分别加入不同浓度的LPS(0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml)和TNF-α(10ng/ml),以构建银屑病角质形成细胞(keratinocyte,KC)模型。③使用蛋白质印迹法(western blot,WB)和流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测过度增殖的银屑病KC模型中B7-H3的表达情况。④慢病毒转染构建B7-H3沉默以及沉默后过表达的HaCaT细胞,并使用细胞单克隆技术获得稳定传代表达的细胞株,通过流式细胞术验证B7-H3转染效果。⑤在B7-H3沉默组和空载病毒对照组中,使用CCK-8(cell counting kit-8)法检测B7-H3对银屑病KC模型增殖能力的影响;实时定量PCR(real-time PCR)检测细胞因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的变化水平。⑥在B7-H3沉默组及其对照组、B7-H3沉默后过表达组及其对照组中,应用流式细胞术检测B7-H3对银屑病KC模型细胞周期的影响。结果:1、免疫组化结果显示,与正常对照皮肤组织相比,银屑病患者皮损组织中B7-H3的表达水平明显升高,尤在表皮基底层更为显著。2、使用LPS、TNF-α干预培养HaCaT细胞,CCK-8法检测细胞增殖活性结果显示:1μg/ml LPS+10ng/ml TNF-α处理组促进HaCaT细胞增殖作用最明显,我们以此浓度构建银屑病KC模型。3、western blot和流式细胞术检测结果证实,和正常HaCaT细胞相比,银屑病KC模型中B7-H3表达水平显著升高。4、慢病毒转染后流式荧光结果显示,沉默组细胞B7-H3表达水平显著低于空载对照组,沉默后过表达组的B7-H3水平则显著高于对照组;使用细胞单克隆技术后重复上述实验,证实获得了稳定表达的细胞株。5、沉默B7-H3显著降低银屑病KC模型增殖能力。6、沉默B7-H3诱导银屑病KC模型分泌炎症性细胞因子IL-6、IL-1β水平明显下降。7、流式荧光检测结果表明,B7-H3沉默可以诱导细胞发生G2期阻滞,抑制细胞增殖,而B7-H3沉默后过表达则可以恢复细胞增殖水平,诱导G1期细胞向S期加速。结论:1.B7-H3在银屑病患者皮损组织中高表达。2.B7-H3可影响KC增殖能力。3.B7-H3能够调控KC的IL-6和IL-1β的分泌水平。
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