在脊椎动物发育过程中,造血干前体细胞（Hematopoietic stem and progenitor cells,HSPCs）从背主动脉腹侧的生血内皮中分化出来,其形成和功能由各种信号通路之间相互作用而控制。斑马鱼已被证明是一种简单的化学遗传学系统,并被用于探究包括造血在内的各种调节器官发生的途径。在本研究中,我们通过斑马鱼囊胚期胚胎原代培养细胞高通量筛选系统发现促进造血的药物BF-170。BF-170现作为阿尔兹海默症Tau蛋白的体内成像探针和植物次生木质部细胞的指示剂,但对脊椎动物造血发育的影响还鲜为人知。因此,我们在斑马鱼胚胎的基础上探讨了BF-170诱导造血干前体细胞生成的分子调控机制和潜在理论。1.斑马鱼囊胚期胚胎原代细胞体外培养系统筛选出诱导造血干前体细胞的药物BF-170我们分别使用Tg（cmyb:GFP）和Tg（mpx:GFP）荧光转基因胚胎的囊胚期原代培养细胞,建立了一种化学筛选新的促造血分子的方法。特异基因启动子驱动的荧光标记目标细胞分别在384孔板中培养,约3000个小分子药物处理培养细胞,并通过自动成像系统分析GFP的表达,进而指示基因cmyb和mpx的表达。在原代培养细胞中发现了97种药物抑制cmyb驱动的GFP强度,25种药物可促进cmyb驱动的GFP表达,其中9种化合物还同时增加mpx驱动的GFP。在斑马鱼胚胎层面上,我们利用整体原位杂交实验（whole mount in situ hybridization,WISH）进一步鉴定了25种候选药物在体内是否促进造血,其中有12种在中间细胞群中增加cmyb的表达,促进了胚胎的初级造血。此外,通过小鼠拟胚体诱导分化实验,添加原代细胞体外培养系统筛选的增加cmyb-GFP阳性细胞荧光的8种药物（其中7种能同时增加mpx驱动的GFP荧光强度）,利用Cell-direcet q RT-PCR检测c-Myb、Mpx、Gata1、Lmo2、Runx1和Scl造血基因的表达,发现8种药物能显著增强至少3个以上造血基因在小鼠胚胎干细胞中的表达。其中,代表性药物BF-170可保守地诱导以上全部造血基因在斑马鱼囊胚期原代培养细胞和小鼠胚胎干细胞中的表达,并在斑马鱼胚胎中间细胞群中也可以显著提升造血相关基因cmyb和lmo2的表达。此外将BF-170应用到辐射恢复实验,我们发现其在体外可以诱导包括造血干前体细胞在内的可移植细胞,成功移植到成鱼的眼睛、胸腺和头肾。综上表明,斑马鱼囊胚期胚胎原代细胞体外筛选系统是一种高效的筛药体系,可有效筛选出在斑马鱼和哺乳动物中保守促进造血的药物BF-170。2.药物BF-170促进造血干前体细胞发育WISH结果表明在初级造血的过程中,BF-170可促进斑马鱼初始造血基因lmo2/scl、造血干前体细胞标记基因cmyb和内皮细胞标记基因flk1的表达。在随后的次级造血中,利用WISH、Cell-direcet q RT-PCR和共聚焦显微镜观察显示,BF-170在28 hpf时上调造血干前体细胞标记基因cmyb/runx1、内皮细胞标记基因fli1/flk1和动脉标记基因ephrin B2a的表达,且促进了造血干前体细胞的增殖;到48 hpf时BF-170持续增加造血干前体细胞和血管的生成。但聚焦到BF-170对造血分化的作用,WISH结果验证BF-170抑制红系细胞和淋巴系细胞的分化,略微促进了髓系细胞基因的表达。综上所述,BF-170诱导HSPCs的生成。3.药物BF-170诱导造血干前体细胞生成的分子调控机制本研究首先发现BF-170能加快胚胎的血流速度,上调klf2a的表达。初级纤毛可传导血流速度的变化到Notch信号通路进而调控造血干前体细胞发生,研究发现BF-170可提高鱼类胚胎纤毛基因pkd2、kif3a、ift88、fsd1的表达,且BF-170挽救fsd1 Morpholinos中HSPCs的减少;同时,BF-170上调了Notch信号通路受体、配体和靶基因的表达,可挽救Notch信号通路抑制剂DAPT处理的胚胎中HSPCs发生的缺陷;诱导Notch信号通路的下游NO信号,进而调控HSPCs发生。综上,本研究表明,BF-170加快血流速度,通过初级纤毛感应传递至Notch信号通路,最后增强NO信号来调控造血干前体细胞生成。在本文中,通过高通量化学筛选方法,提高了鉴定促进体外造血药物的效率,并创新性发现药物BF-170对HSPCs的正调控作用,并揭示了BF-170在斑马鱼胚胎中诱导造血干前体细胞生成的信号调控网络。本研究不仅提供了新的筛药方法,还为造血干前体细胞发育完善了分子调控机制的理论依据。