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目的:1、以3×Tg-AD小鼠作为阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的动物模型,深入探讨AD的发病机制;2、评价木犀草素对AD的潜在治疗作用;3、探索木犀草素改善AD的作用机制。方法:(1)将8月龄3×Tg-AD小鼠以及C57BL/6J野生小鼠分为4组:野生对照组(WT-Con)、模型组(3×Tg-AD)、木犀草素给药组(3×Tg-AD+Lut 20 mg/kg、3×Tg-AD+Lut 40 mg/kg)。给药组连续腹腔注射给予木犀草素21天,野生对照组和模型组腹腔注射给予相应的溶剂。同时选用C6胶质瘤细胞系,设置4个实验组:正常对照组(Con),溶剂处理的C6细胞;炎症模型组(LPS),C6细胞+LPS 2μg/m L;给药组,C6细胞+LPS2μg/m L+Lut 1μmol/L;C6细胞+LPS 2μg/m L+Lut 10μmol/L。(2)在小鼠给药结束后进行水迷宫实验,评估小鼠的空间学习记忆能力;采用尼氏染色法观察石蜡切片中海马区神经元的改变;硫磺素S染色法观察石蜡切片中淀粉样蛋白斑块;使用EDU细胞增殖检测试剂盒检测C6细胞的过度激活;酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测脑组织匀浆和细胞培养基上清中肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的含量,酶法检测新鲜脑组织匀浆和细胞培养基上清中一氧化氮(nitric oxide,NO)水平;免疫蛋白印迹法检测新鲜脑组织和细胞中胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、环氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)、核转录因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κBp65)、磷酸化核转录因子κB(p-NF-κBp65)、p38和p-p38的表达;免疫组织化学法检测小鼠脑组织中GFAP、葡萄糖调节蛋白78(glucose regulatory protein 78,GRP78)和肌醇需酶1α(inositol requiring enzyme 1,IRE1α)的表达;免疫荧光双染检测小鼠脑组织石蜡切片中GFAP和GRP78的共定位情况。结果:(1)木犀草素治疗改善了3×Tg-AD小鼠的空间学习记忆缺陷及病理变化。水迷宫结果显示,与野生型小鼠相比,3×Tg-AD模型小鼠运动轨迹混乱,目的性弱,逃避潜伏期明显延长,在目标象限运动的时间、游泳距离以及撤去平台之后穿越平台次数均减少;而木犀草素治疗之后,小鼠运动轨迹的目的性增强,逃避潜伏期较3×Tg-AD模型小鼠缩短,在目标象限运动时间、游泳距离及穿越平台次数有所增加。尼氏染色结果显示,3×Tg-AD模型小鼠海马区的尼氏小体明显减少,细胞排列散乱,空泡化现象严重;而木犀草素治疗的小鼠海马区尼氏小体增多,细胞恢复紧密排列,空泡化现象减少。硫磺素S染色结果显示,3×Tg-AD模型小鼠脑部存在明显的β-淀粉样蛋白(amyloid-βpeptide,Aβ)沉积形成的淀粉样蛋白斑块,而木犀草素治疗之后,淀粉样蛋白斑块的数目减少。(2)木犀草素可以抑制反应性星形胶质细胞的增多及神经炎症反应。在3×Tg-AD模型小鼠脑部,反应性星形胶质细胞标志物GFAP蛋白的表达显著增多,而木犀草素治疗则降低了GFAP的表达;在LPS诱导的C6细胞中,细胞增殖增加且GFAP表达增多,而木犀草素预处理可以下调GFAP的表达,抑制C6细胞增殖,说明木犀草素抑制了体内外AD模型中反应性星形胶质细胞的过度激活。在3×Tg-AD模型小鼠新鲜脑组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的产生升高,促炎蛋白i NOS、COX-2表达增多,而木犀草素治疗降低了炎症因子水平和炎症蛋白的表达;在LPS诱导的C6细胞培养基上清中,炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和NO的水平升高,炎症蛋白i NOS、COX-2表达增加,给予木犀草素预处理后,炎症因子水平降低,炎症蛋白表达减少。说明木犀草素可以有效抑制体内外AD模型中神经炎症的发生。(3)木犀草素可以抑制星形胶质细胞的内质网应激和炎症信号通路。在LPS诱导的C6细胞中,内质网应激蛋白GRP78、IRE1α水平升高,并且炎症通路信号分子p-NF-κB、p-p38表达升高,提示C6细胞中发生内质网应激并且炎症通路被激活,而木犀草素预处理可以抑制内质网应激的发生,抑制炎症通路的激活;在3×Tg-AD模型小鼠脑组织中,内质网应激相关蛋白GRP78、IRE1α表达增多,炎症通路信号分子p-NF-κB、p-p38表达升高,而木犀草素治疗抑制了内质网应激相关蛋白的表达,同时也抑制了炎症通路的激活;免疫荧光双染结果显示,GFAP和GRP78共定位显著增加,说明在3×Tg-AD小鼠中的星形胶质细胞内发生了内质网应激;而木犀草素治疗可以降低共定位现象,提示木犀草素可以通过抑制星形胶质细胞的内质网应激来抑制神经炎症。结论:星形胶质细胞中过度的内质网应激促进神经炎症的发生,造成神经元微环境毒性增加,引起神经元功能受损,导致学习记忆能力下降。木犀草素可能通过抑制模型小鼠星形胶质细胞的内质网应激进而抑制炎症的加剧,改善神经元微环境,减轻神经元损伤,缓解模型小鼠学习记忆能力障碍。