目的:研究elesclomol对伤口愈合中增生性瘢痕生成及HS中过度活化的肌成纤维细胞的影响并探讨其作用机制。方法:在体内,以新西兰白兔为研究对象建立兔耳增生性瘢痕模型,以研究elesclomol对增生性瘢痕形成的影响。以HE和MASSON三色染色法评估瘢痕增生和胶原纤维形态学特征;免疫组化法评价增生性瘢痕相关蛋白表达变化;对兔耳瘢痕切片α-SMA和TUNEL的荧光染色共定位以确定组织中凋亡的肌成纤维细胞。在体外,取患者增生性瘢痕培养肌成纤维细胞,通过DAPI染色观察elesclomol对肌成纤维细胞凋亡的影响,并通过流式细胞术进一步验证;α-SMA/F-actin荧光染色双染、胶原蛋白凝胶收缩实验(CGC)测定肌成纤维细胞表型和收缩力的变化;流式细胞术和Western blot蛋白检测研究产生凋亡作用的分子机制;最后细胞划痕试验评价elesclomol对细胞迁移产生的影响。结果:1.Elesclomol对兔耳增生性瘢痕形成的作用(1)Elesclomol对兔耳HS的形态学及组织学的影响我们首先制备兔耳增生性瘢痕模型,模型成功后将动物随机分为3组,每组4只,空白对照组给予针尖注射刺激,溶剂对照组给予DMSO,实验组给予elesclomol,连续14天,随后组织取样,常规石蜡切片后作病理学检查。结果显示:与空白对照组和溶剂对照组相比,药物治疗组的兔耳外观可见瘢痕变得更平坦且范围缩小,瘢痕边界与正常皮肤逐渐相融;形态学上给药组的胶原纤维排列由对照组的紊乱变得整齐。由此证明elesclomol对兔耳增生性瘢痕形成具有抑制作用。(2)Elesclomol对兔耳HS横截面积和SEI值的影响我们用苏木精和伊红(HE)染色和MASSON三色染色方法探讨了药物对兔耳HS横截面积和SEI值影响。结果显示:与空白对照组和溶剂对照组相比,给药组的SEI值明显降低,由空白对照组的5.68±0.74和溶剂对照组的6.27±1.31,降至给药组的2.41 ±0.34(P<0.01):瘢痕横截面积也明显减小,空白对照组面积为2.06±0.38 mm2,溶剂对照组面积为2.17±0.22mm2,给药组面积为0.92±0.14mm2(P<0.01)。(3)Elesclomol对兔耳HS胶原蛋白、α-SMA、TGF-β1蛋白表达的影响我们对以上三组切片进行免疫组化检查。与溶剂对照组相比,给药组各蛋白表达均下降且具有统计学差异,其中,光密度检测结果显示:胶原蛋白I由溶剂对照组的0.157±0.008降至给药组的0.103±0.007(P<0.01);胶原蛋白III由溶剂对照组的0.103±0.009 降至给药组的 0.068±0.008(P<0.01);α-SMA 由溶剂对照组的 0.126±0.010降至给药组的0.081±0.008(P<0.01);TGF-β1由溶剂对照组的0.138±0.007降至给药组的0.088±0.009(P<0.01)。由此说明,elesclomol对与瘢痕增生相关蛋白表达具有抑制作用。(4)Elesclomol对兔耳HS肌成纤维细胞凋亡的影响我们用TUNEL显色法检查兔耳增生性瘢痕组织切片中凋亡细胞情况。结果显示:单位面积内凋亡数由空白对照组的9.2±3.1和溶剂对照组的10.9±2.8增至给药组的32.4±4.7(P<0.01);免疫荧光双染进一步显示用药后组织内TUNEL+/α-SMA-细胞的表达比例由空白对照组的4.5±0.19和溶剂对照组的10.1±3.14增至给药组的44.7±5.26(P<0.01)。以上实验结果显示:与空白对照组相比,溶剂对照组阳性反应强烈,说明DMSO对瘢痕增生也有影响;而与溶剂对照组相比,给药组肌成纤维细胞凋亡比率均增加且差异具有统计学意义,证明elesclomol体内给药能促进兔耳HS肌成纤维细胞凋亡。2.Elesclomol对人皮肤肌成纤维细胞凋亡的作用(1)Elesclomol在体外促进HS来源的人肌成纤维细胞的凋亡体外细胞实验显示,elesclomol在2μM～50μM的浓度区间内能显著抑制人肌成纤维细胞的增殖,我们就此探讨了该效应产生的可能原因。DAPI染色结果显示:当给予elesclomol后,DAPI阳性细胞数比率由对照组(0μM)的3.12±0.18%增至elesclomol实验组 2μM的 12.09±0.24%,10μM 的38.09±2.58%和 50μM 的 45.26±3.34%(P<0.01);流式细胞术结果显示:细胞凋亡率由对照组(0μM)的2.93±1.18%增至elesclomol实验组 2μM 的 6.19±1.35%,10μM 的 9.12±2.38%和 50μM 的 16.37±3.24%(P<0.01)。以上实验结果证明:elesclomol能促进人肌成纤维细胞的凋亡。(2)Elesclomol调节人肌成纤维细胞的表型和收缩力我们用α-SMA/F-actin双染和胶原蛋白凝胶收缩实验分析elesclomol对肌成纤维细胞的表型和收缩力的影响,选用10 μM elesclomol处理48 h,结果显示:与TGF-β1诱导组对比,给药后肌成纤维细胞标志物α-SMA水平显著降低,α-SMA(+)细胞数比率由TGF-β1诱导组的65.74±4.44%降至给药组的48.37±5.29%(P<0.01),凝胶轮廓与孔轮廓的比率也由62.35±1.98%降至19.97±1.07%(P<0.01),证明给药后对应细胞表型的变化及收缩力的明显下降。(3)Elesclomol通过增加氧化应激促进肌成纤维细胞凋亡流式和WB结果显示:elesclomol给药组中的细胞产生过量活性氧ROS,与对照组相比,平均荧光度值由对照组(0μM)的80.9±2.2增加到elesclomol实验组2μM的98.9±4.8,10μM 的 109.0±5.3 和 50μM 的 131.0±4.7(P<0.01);此外,凋亡蛋白 caspase-3、cleaved caspase-3和细胞色素c的表达随elesclomol浓度增加而逐渐增加,结果显示:与对照组相比,caspase-3/β-actin 由对照组(0μM)的 0.5872±0.074 增加到 elesclomol实验组 2μM 的 0.7234±0.048,10μM 的 1.0933±0.093 和 50μM 的 1.2734±0.087(P<0.01);cleaved caspase-3/β-actin 由对照组(0μM)的 0.1261±0.080 增加到 elesclomol 实验组 2μM的 0.2724±0.123,10μM 的 0.3873±0.085 和 50μM 的 0.4528±0.043(P<0.01);cytochrome c/β-actin 由对照组(0μM)的 0.0621±0.047 增加到 elesclomol实验组2μM的 0.1367±0.059,10μM 的 0.4838±0.028 和 50μM 的 0.6249±0.081(P<0.01),证明了用 elesclomol 处理能通过提高氧化应激水平来诱导肌成纤维细胞的凋亡。(4)Elesclomol浓度依赖性地抑制肌成纤维细胞迁移我们用不同浓度elesclomol对肌成纤维细胞进行处理,观察0小时到24小时的细胞迁移情况,结果显示:与对照组(0μM)相比,随着elesclomol浓度的逐渐增加,12小时的细胞迁移率由0μM的21.47±2.07%分别下降至elesclomol实验组2μM的16.38±1.28%,10μM 的 11.48±0.93%和 50μM 的 8.37±1.02%(P<0.01);24 小时的细胞迁移率由0μM的32.07±2.48%分别下降至elesclomol实验组2μM的24.27±2.03%,10μM 的 18.58±1.83%和50μM的12.35±1.29%(P<0.01)。证明了 elesclomol 能抑制肌成纤维细胞的迁移。结论:Elesclomol对增生性瘢痕具有显著抑制作用,此作用产生的部分原因是通过促进肌成纤维细胞凋亡及抑制肌成纤维细胞迁移实现的。