研究背景:食管癌是常见的消化道恶性肿瘤,是全球癌症相关死亡的第六大主要原因。我国是食管癌发病率较高的国家之一,尤其是河南、四川和福建等省,是食管癌的高发地区。冬凌草最早发现于河南省济源市的王屋山地区,其对于食管癌具有独特的治疗作用。研究表明冬凌草中的四环二萜类化合物——冬凌草甲素,是冬凌草主要的抗癌活性成分,对于多种癌细胞的生长均表现出较好的抑制作用。目前,冬凌草甲素的抗食管癌作用已经从基因和蛋白等生物大分子层面上广泛研究,但是很少有人从小分子代谢物层面系统研究冬凌草甲素抑制食管癌细胞增殖的分子机制。研究目的:从系统生物学角度出发,采用UPLC-MS/MS代谢组学技术研究冬凌草甲素抗食管癌作用的分子机制,以期为冬凌草甲素的临床应用及抗癌药物的研发提供理论基础。研究方法:1.采用MTT实验研究冬凌草甲素对TE1细胞活性的影响;2.采用流式细胞术研究冬凌草甲素对TE1细胞凋亡、细胞周期以及细胞内活性氧(ROS)水平的影响;3.通过细胞内Fe2+含量测定和丙二醛(MDA)含量测定实验,以及铁死亡抑制剂去铁胺对细胞活性的影响实验,研究冬凌草甲素对TE1细胞铁死亡的诱导作用。4.采用UPLC-MS/MS对冬凌草甲素组和对照组的TE1细胞样本进行内源性小分子代谢物的分析;通过小分子化合物快速鉴定和分析软件OSI-SMMS对代谢物进行鉴定和分析;通过SIMCA软件进行模式判别分析;按照VIP>1和P<0.05的标准筛选差异代谢物,并使用Metaboanalyst网站对差异代谢通路进行分析。5.采用酶联免疫吸附法对γ-谷氨酰转移酶1(GGT1)、谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(GCLC)以及谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)进行分析。6.采用高分辨质谱对冬凌草甲素分别与半胱氨酸、谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸的结合物进行结构确证。7.采用UPLC-MS/MS对冬凌草甲素分别与半胱氨酸、谷胱甘肽和γ-谷氨酰半胱氨酸结合物的含量进行分析,同时测定细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量,得到GSH/GSSG的比值。8.采用荧光显微镜进行荧光拍照,分析冬凌草甲素对TE1细胞线粒体膜电位和细胞内ROS水平的影响。研究结果:1.冬凌草甲素对食管癌细胞TE1增殖的抑制作用:MTT实验结果显示,冬凌草甲素作用于TE1细胞24 h和48 h后的IC50值分别为26.93 μM和18.95μM。流式细胞术分析结果显示冬凌草甲素显著诱导细胞凋亡并促进细胞阻滞于G2/M期。铁死亡相关实验结果显示,铁死亡抑制剂去铁胺可显著减弱冬凌草甲素对TE1细胞的抑制作用,同时,冬凌草甲素以剂量依赖性方式增加细胞内Fe2+、MDA以及ROS的水平,表明冬凌草甲素可诱导TE1细胞发生铁死亡。2.冬凌草甲素对TE1细胞γ-谷氨酰循环的抑制作用:模式判别分析结果显示本实验所建模型不存在过拟合现象,OPLS-DA图中对照组和冬凌草甲素组之间呈现明显的分离。通过VIP>1和P<0.05,在对照组和冬凌草甲素组之间共筛选出23种具有显著性差异的内源性代谢物,包括:GSH、GSSG、谷氨酸、5-氧脯氨酸、γ-谷氨酰亮氨酸、γ-谷氨酰缬氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸等。通路分析和富集分析显示,这些差异代谢物主要参与谷胱甘肽代谢、谷氨酸代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、尿素循环等,其中谷胱甘肽代谢的变化最为显著。酶联免疫吸附法的结果显示,γ-谷氨酰循环(“谷胱甘肽补救”途径)中的关键酶GGT1和GCLC的活性在冬凌草甲素给药组均显著降低,表明冬凌草甲素可抑制TE1细胞的γ-谷氨酰循环。同时,冬凌草甲素作用后GPX4的活性显著降低,表明TE1细胞内谷胱甘肽氧化还原平衡的失调。3.冬凌草甲素通过共价结合半胱氨酸巯基抑制γ-谷氨酰循环:通过与化学合成的冬凌草甲素结合物进行保留时间和二级谱图的比较,确证冬凌草甲素可在TE1细胞内分别与半胱氨酸、谷胱甘肽以及γ-谷氨酰半胱氨酸发生共价结合形成结合物Ori-Cys、Ori-GSH和Ori-Glu-Cys,并且结合规律的分析结果表明,这种结合作用在冬凌草甲素作用于TE1细胞2 h后就已经显著。UPLC-MS/MS分析显示,细胞内GSH和GSSG的含量以及GSH/GSSG的比值在冬凌草甲素作用2h后显著降低,同时,ROS荧光拍照结果显示随着冬凌草甲素作用时间的延长,细胞内ROS的水平逐渐升高。由此说明冬凌草甲素通过与半胱氨酸巯基发生共价结合,抑制GSH的合成和活性,从而抑制Y-谷氨酰循环。研究结论:1.冬凌草甲素可通过诱导细胞凋亡、促进细胞周期阻滞于G2/M期以及诱导细胞发生铁死亡,抑制TE1细胞的增殖。2.冬凌草甲素通过降低GGT1的活性以及与半胱氨酸巯基发生共价结合抑制γ-谷氨酰循环,导致细胞内谷胱甘肽氧化还原平衡失调,最终抑制TE1细胞的增殖。