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目的:糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)是糖尿病(diabeticmellitus,DM)最常见的微血管病变之一,其发病机制不清,病理学特征早期表现为肾小球肥大、系膜增生,后期则以肾小球、肾间质纤维化为特征。目前研究认为:转化生长因子-β(TGF-β)与肾纤维化改变密切相关,是引起DN发病的关键性细胞因子之一。TGF-β／Smad信号通路激活后,使肾小管上皮细胞间质转分化(Epithelial-Mesenchymal Fransition,EMT),细胞外基质合成增加,降解减少,致细胞外基质不断集聚,最终引起肾组织纤维化。SnoN蛋白是细胞核内重要的转录共抑制因子。研究发现SnoN通过与TGF-β下游的Smad蛋白相互作用,抑制TGF-β信号产生的细胞效应,而SnoN蛋白主要受泛素化降解调节。由于SnoN所介导的转录活性的抑制发生于核内,且恰好发生于TGF-β靶基因转录之前,决定了SnoN在调控TGF-β／smad信号通路中有重要作用。故本实验以链脲佐菌素(STZ)一次性腹腔注射建立早期1型糖尿病肾病大鼠模型,用特异性蛋白酶体抑制剂MG132腹腔注射治疗作为干预因素,探讨在糖尿病大鼠早期肾病发病中转录共抑制因子SnoN蛋白表达及与泛素化的关系,并探讨以蛋白酶体抑制剂治疗糖尿病肾病的可行性。
方法:1、糖尿病大鼠模型的建立及分组:雄性Wistar大鼠30只,随机分为糖尿病模型组(20只)和正常对照组(Normal control,NC组,10只)。模型组一次性腹腔注射链脲佐菌素STZ(60mg／kg),对照组给予等体积的枸橼酸缓冲液,成模后随机分成两组:糖尿病对照组(Diabetes control,DC组)和糖尿病MG132治疗组(Diabetes therapy,DT组)。DT组按0.1mg／kg.d腹腔注射蛋白酶体抑制剂MG132,DC组和NC组每天给予等体积的0.9％生理盐水腹腔注射。2、6周和8周时收集各组大鼠尿液检测24小时尿微量白蛋白；心脏采血检测空腹血糖、胱抑素C(CysC)。3、肾脏组织病理检查:清洁取肾,石蜡包埋,行HE和Masson染色,观察肾小球和肾小管间质的基本病理改变及纤维化改变的情况。4、免疫组化及蛋白免疫印迹(Western-blot)检测各组肾脏组织SnoN蛋白的表达。5、实时荧光定量RT-PCR检测各组肾脏组织SnoN的mRNA表达。6、统计学处理:应用SPSS13.0统计软件分析数据,数据以均数±标准差((x)±S)表示,用单因素方差分析检测组间差异,两个组之间进行比较采用q检验,以独立样本均数t检验比较组内差异,以α=0.05为检验标准,P<0.05表示差异存在统计学意义。
结果:1、大鼠基本情况:①体重:与NC组比较,模型组体重明显减轻,DT组体重较DC组增加；各组8周时差异更明显(P<0.05)。②血糖:NC组血糖在正常水平波动,模型组血糖较NC组明显升高(P<0.05),DT组与DC组间血糖差异无统计学意义(P>0.05)；各组8周与6周血糖呈相同趋势,二者间无显著差异(P>0.05)。③胱抑素C(CysC):各组间差异及8周与6周间比较均无显著统计学意义(P>0.05)。④24小时尿蛋白定量:与NC组比较,模型组出现微量蛋白尿,以DC组显著,差异有统计学意义(P<0.05)；各组8周与6周呈相同趋势,二者比较无显著差异。2、HE、Masson染色:①HE染色显示:与NC组比较,DC组肾小球体积增大,肾小管肿胀,DT组较DC组肾小球体积减小；8周较6周肾小球体积增大,肾小管肿胀加重,与6周呈相同趋势。②Masson染色发现:与NC组比较,DC组可见肾间质蓝色阳性物质沉积增多,DT组较DC组减少；8周较6周蓝色阳性物质沉积增多,与6周呈相同趋势。3、肾组织SnoN蛋白免疫组化表达:正常NC组肾脏组织可见SnoN蛋白表达,与NC组比较,DC组SnoN蛋白的表达量减少,DT组较DC组表达增多。8周较6周表达量减少,与6周表达趋势相同。4、wester-blot检测肾组织SnoN蛋白:SnoN蛋白电泳条带做灰度值分析得到结果,NC组检测有较高水平SnoN蛋白表达,DC组较NC组SnoN蛋白表达明显减少,MG132治疗的DT组较DC组SnoN蛋白表达量增加(P<0.05)；各组8周比6周蛋白表达水平均降低,与6周呈相同趋势(P<0.05)。5、肾组织SnoN mRNA表达:各组间SnoNmRNA的表达无显著差异,8周与6周间比较无显著差异(P<0.05)。
结论:1、早期糖尿病肾病大鼠的SnoN蛋白因泛素化降解而呈低表达。2、蛋白酶体抑制剂可抑制糖尿病肾病时SnoN蛋白的泛素化降解,通过抑制TGF-β通路的激活,对DN具有治疗作用。