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摘要：目的：主要对托瑞米芬的抗肿瘤作用机制以及其与顺铂的联合应用对癌细胞的治疗效应进行研究，探索治疗肺癌的新方向。方法：通过MTT的显色法对托瑞米芬以及其与顺铂联合之后在A549细胞上产生的毒性作用，将吸光度值测定出来。对DNA的含量用流式细胞仪进行检测，对p21蛋白表达的检测运用Western blot法。结果：托瑞米芬可以A549细胞的生长起到直接抑制的作用，5μmol/L以上的托米瑞芬可以将顺铂对细胞的毒性作用显著增强[1]。运用托瑞米芬可以明显增强顺铂对于M期、G2期、以及S期细胞的作用，两者联合运用之后可以增加p21蛋白表达。结论：5μmol/L以上的托米瑞芬和顺铂联用在A549细胞上可以起到显著协同的抗肿瘤的效应。
关键词：托瑞米芬；抗肿瘤作用机制；肺癌；研究分析
中图分类号：R563 文献标识码：C 文章编号：1005-0515（2013）8-120-02
顺铂是在肺癌治疗中非常重要的一种化疗药物，然而因为在化疗过程中会形成耐药性，就会较大限制顺铂的作用。我们通过运用托瑞米芬与顺铂联合作用对人体中的肺腺癌A549细胞生长产生的抑制作用的观察，对其可能机制进行明确，在综合治疗肺癌方面提供新的发展方向[2]。
1资料与方法
1.1运用的材料和方法
1.1.1试剂和药品 芬兰的奥立安药厂生产的托瑞米芬、昆明的三戍药厂生产的顺铂，美国的Hyclone公司的RPMI-1640的培养基，华美公司的MTT，美国Sigma公司的胰蛋白酶和二甲基亚砜（DM-SO），美国的Callbiochem公司的p21wafl抗体，美国的Santa Cluz公司的抗鼠辣根过氧化物酶[3]，美国的PIERCE公司生产的T-PERTM的组织蛋白提取剂，美国的Bio-RAD公司生产的Micro-Plate Reader Model550型酶联免疫的检测仪，美国的Becton-Dickinson公司生产的Facscalibur型的流式细胞仪。
1.1.2细胞系的培养 人体的肺腺癌细胞是A549来自中国科学院的上海生物细胞研究所，在含有5%的二氧化碳，温度为37摄氏度的温箱中进行培养，RPMI-1640作为培养液[4]。肺癌细胞是贴壁生长的，在两到三天之后用0.25%的胰蛋白酶进行消化和传代。
1.1.3实验的分组 主要设置加入100μl培养基的空白组和加入100μl单细胞悬液的对照组以及加入处理因素和100μl单细胞悬液的实验组。其中实验组还分为联合用药组、化疗药物组、托瑞米芬组[5]。
1.2治疗的方法 通过MTT的显色法对托瑞米芬以及其与顺铂联合之后在A549细胞上产生的毒性作用，将吸光度值测定出来。对DNA的含量用流式细胞仪进行检测。提取培养出来的细胞总蛋白，与Western blot的印记进行杂交，对p21wafl蛋白表达的水平进行检测[6]。具体的操作步骤为：在六孔板中把A549的细胞株进行接种，RPMI-1640作为培养液，在其中分别加入顺铂、托瑞米芬和两者的结合物，将空白的对照设置出来，在经过二十四小时的培养之后将培养液倒掉，用PBS液冲洗三次，在其中加入T-PERTM的组织蛋白提取剂，对细胞进行溶解和裂解，将蛋白提取出来。在沸水中把样品加热十分钟，用每分钟10000r进行十分钟离心，对上清进行吸取。进行SDS的凝胶电泳，通过电转移的方法把蛋白移至硝酸纤维的素膜上，在运用50g/L的脱脂奶粉封闭之后再在其中加入p21wafl的单克隆抗体，两个小时之后，运用PBS液冲洗三次，再将二抗加入，两个半小时之后，再将化学发光剂加入，将暗盒放入、压片，十分钟之后，显影、定影[7]。
1.3统计学的处理 采用SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，p<0.05说明具有统计学意义。
2结果
托瑞米芬对于A549的细胞生长产生了一定的抑制作用，如表一所示，5μmol/L以上的托米瑞芬可以将顺铂对细胞的毒性作用显著增强，存在的差异具有明显的统计学意义（p<0.05）。运用托瑞米芬可以明显增强顺铂对于M期、G2期、以及S期细胞的作用，两者联合运用之后可以增加p21蛋白表达。具体的情况见表一、表二。
3讨论
通过研究表明，在单独运用托瑞米芬的时候可以对A549细胞的生长起到一定的抑制作用，抑制的作用会随着浓度的增加而逐渐增强。然而如果仅仅靠药物的剂量并不能达到将抑制的效应提高到理想的效果，有时还会适得其反，会有一些毒副作用产生[8]。托瑞米芬与顺铂联合所产生的协同作用是非常显著的，尽管各自的药量都降低了，但是其对癌细胞所产生的毒性作用依然大于这两种药物单独使用。根据目前的研究的情况来看，托瑞米芬在对癌细胞增殖产生的抑制作用和与化疗药物协同的作用机制还不是非常明显。根据流式细胞仪的检测不难发现，托瑞米芬与顺铂联合之后，细胞周期阻断的时期产生变化了，G2和S期的比例下降了[9]，G1期的细胞运动受到了阻滞，这就说明了托瑞米芬在癌细胞的DNA合成以及合成后期和有丝分裂期的作用，会阻断整个繁殖的周期，对细胞的生长起到一定的抑制作用。
参考文献：
[1]李大鹏，张磊，李艳.托瑞米芬抗肿瘤作用机制及肺癌治疗中的应用[J].吉林医药学院学报，2012，12（3）：12-13.
[2]刘利则，夏莉，刘玉侠，段北野.托瑞米芬逆转肺癌耐药细胞株A549/cDDP耐药性的研究[J].中国免疫学杂志，2012，28（12）：1078-1081.
[3]周易冬，沈松杰，孙强，关竞红，茅枫.托瑞米芬治疗绝经前妇女周期性乳痛症的安全性和有效性临床研究[J].中华乳腺病杂志（电子版），2012，6（5）：29-32.
[4]李大鹏，张磊，赵东海.托瑞米芬联合长春瑞滨对兔VX2肿瘤模型影响的实验研究[J].中国医药科学，2012，2（10）：29-31.
[5]孟芹，丁兆军，迟玉华，周彩存，粟波.托瑞米芬联合顺铂对p53缺失型肺癌细胞株H1299生长抑制作用的研究[J].中国医药，2012，7（8）：947-949.
[6]林平，傅晓钦，钱飞中，刘文涵.顶空气相色谱法测定枸橼酸托瑞米芬原料药中溶剂残留量[J].中国药房，2011，22（1）：47-49.
[7]安东建，柴琴，田垣，苏天海，汤效，谢熠.大剂量托瑞米芬逆转肺癌多药耐药及化疗增敏的临床研究[J].中国肿瘤临床与康复，2009，10（1）：36-38.
[8]安东建，柴琴，田垣，苏天海，汤效，谢熠.大剂量托瑞米芬加NP方案治疗48例非小细胞肺癌的毒性反应观察[J].中国肿瘤，2009，18（7）：587-588.
[9]鲁冰，倪健，周彩存.托瑞米芬联合长春瑞滨和顺铂二线治疗中晚期非小细胞肺癌的疗效[J].肿瘤，2010，15（2）：148-151.
关键词：托瑞米芬；抗肿瘤作用机制；肺癌；研究分析
中图分类号：R563 文献标识码：C 文章编号：1005-0515（2013）8-120-02
顺铂是在肺癌治疗中非常重要的一种化疗药物，然而因为在化疗过程中会形成耐药性，就会较大限制顺铂的作用。我们通过运用托瑞米芬与顺铂联合作用对人体中的肺腺癌A549细胞生长产生的抑制作用的观察，对其可能机制进行明确，在综合治疗肺癌方面提供新的发展方向[2]。
1资料与方法
1.1运用的材料和方法
1.1.1试剂和药品 芬兰的奥立安药厂生产的托瑞米芬、昆明的三戍药厂生产的顺铂，美国的Hyclone公司的RPMI-1640的培养基，华美公司的MTT，美国Sigma公司的胰蛋白酶和二甲基亚砜（DM-SO），美国的Callbiochem公司的p21wafl抗体，美国的Santa Cluz公司的抗鼠辣根过氧化物酶[3]，美国的PIERCE公司生产的T-PERTM的组织蛋白提取剂，美国的Bio-RAD公司生产的Micro-Plate Reader Model550型酶联免疫的检测仪，美国的Becton-Dickinson公司生产的Facscalibur型的流式细胞仪。
1.1.2细胞系的培养 人体的肺腺癌细胞是A549来自中国科学院的上海生物细胞研究所，在含有5%的二氧化碳，温度为37摄氏度的温箱中进行培养，RPMI-1640作为培养液[4]。肺癌细胞是贴壁生长的，在两到三天之后用0.25%的胰蛋白酶进行消化和传代。
1.1.3实验的分组 主要设置加入100μl培养基的空白组和加入100μl单细胞悬液的对照组以及加入处理因素和100μl单细胞悬液的实验组。其中实验组还分为联合用药组、化疗药物组、托瑞米芬组[5]。
1.2治疗的方法 通过MTT的显色法对托瑞米芬以及其与顺铂联合之后在A549细胞上产生的毒性作用，将吸光度值测定出来。对DNA的含量用流式细胞仪进行检测。提取培养出来的细胞总蛋白，与Western blot的印记进行杂交，对p21wafl蛋白表达的水平进行检测[6]。具体的操作步骤为：在六孔板中把A549的细胞株进行接种，RPMI-1640作为培养液，在其中分别加入顺铂、托瑞米芬和两者的结合物，将空白的对照设置出来，在经过二十四小时的培养之后将培养液倒掉，用PBS液冲洗三次，在其中加入T-PERTM的组织蛋白提取剂，对细胞进行溶解和裂解，将蛋白提取出来。在沸水中把样品加热十分钟，用每分钟10000r进行十分钟离心，对上清进行吸取。进行SDS的凝胶电泳，通过电转移的方法把蛋白移至硝酸纤维的素膜上，在运用50g/L的脱脂奶粉封闭之后再在其中加入p21wafl的单克隆抗体，两个小时之后，运用PBS液冲洗三次，再将二抗加入，两个半小时之后，再将化学发光剂加入，将暗盒放入、压片，十分钟之后，显影、定影[7]。
1.3统计学的处理 采用SPSS18.0软件进行统计学分析，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，p<0.05说明具有统计学意义。
2结果
托瑞米芬对于A549的细胞生长产生了一定的抑制作用，如表一所示，5μmol/L以上的托米瑞芬可以将顺铂对细胞的毒性作用显著增强，存在的差异具有明显的统计学意义（p<0.05）。运用托瑞米芬可以明显增强顺铂对于M期、G2期、以及S期细胞的作用，两者联合运用之后可以增加p21蛋白表达。具体的情况见表一、表二。
3讨论
通过研究表明，在单独运用托瑞米芬的时候可以对A549细胞的生长起到一定的抑制作用，抑制的作用会随着浓度的增加而逐渐增强。然而如果仅仅靠药物的剂量并不能达到将抑制的效应提高到理想的效果，有时还会适得其反，会有一些毒副作用产生[8]。托瑞米芬与顺铂联合所产生的协同作用是非常显著的，尽管各自的药量都降低了，但是其对癌细胞所产生的毒性作用依然大于这两种药物单独使用。根据目前的研究的情况来看，托瑞米芬在对癌细胞增殖产生的抑制作用和与化疗药物协同的作用机制还不是非常明显。根据流式细胞仪的检测不难发现，托瑞米芬与顺铂联合之后，细胞周期阻断的时期产生变化了，G2和S期的比例下降了[9]，G1期的细胞运动受到了阻滞，这就说明了托瑞米芬在癌细胞的DNA合成以及合成后期和有丝分裂期的作用，会阻断整个繁殖的周期，对细胞的生长起到一定的抑制作用。
参考文献：
[1]李大鹏，张磊，李艳.托瑞米芬抗肿瘤作用机制及肺癌治疗中的应用[J].吉林医药学院学报，2012，12（3）：12-13.
[2]刘利则，夏莉，刘玉侠，段北野.托瑞米芬逆转肺癌耐药细胞株A549/cDDP耐药性的研究[J].中国免疫学杂志，2012，28（12）：1078-1081.
[3]周易冬，沈松杰，孙强，关竞红，茅枫.托瑞米芬治疗绝经前妇女周期性乳痛症的安全性和有效性临床研究[J].中华乳腺病杂志（电子版），2012，6（5）：29-32.
[4]李大鹏，张磊，赵东海.托瑞米芬联合长春瑞滨对兔VX2肿瘤模型影响的实验研究[J].中国医药科学，2012，2（10）：29-31.
[5]孟芹，丁兆军，迟玉华，周彩存，粟波.托瑞米芬联合顺铂对p53缺失型肺癌细胞株H1299生长抑制作用的研究[J].中国医药，2012，7（8）：947-949.
[6]林平，傅晓钦，钱飞中，刘文涵.顶空气相色谱法测定枸橼酸托瑞米芬原料药中溶剂残留量[J].中国药房，2011，22（1）：47-49.
[7]安东建，柴琴，田垣，苏天海，汤效，谢熠.大剂量托瑞米芬逆转肺癌多药耐药及化疗增敏的临床研究[J].中国肿瘤临床与康复，2009，10（1）：36-38.
[8]安东建，柴琴，田垣，苏天海，汤效，谢熠.大剂量托瑞米芬加NP方案治疗48例非小细胞肺癌的毒性反应观察[J].中国肿瘤，2009，18（7）：587-588.
[9]鲁冰，倪健，周彩存.托瑞米芬联合长春瑞滨和顺铂二线治疗中晚期非小细胞肺癌的疗效[J].肿瘤，2010，15（2）：148-151.