论文部分内容阅读
摘要 以高中化学新课标教材中有关氨基酸、蛋白质的知识为切入点,介绍绿色荧光蛋白的结构特点、生色团与发光特性、优点及应用,为一线教师提供前沿化学知识。
关键词 高中化学;绿色荧光蛋白;新课标
中图分类号:G633.8 文献标识码:B 文章编号:1671-489X(2009)24-0030-02
Introduction of Green Fluorescent Protein: To Help Implementation of New Curriculum Standard//Liu Xiaocui, Wang Mingzhao
Abstract The structure, chromophore, fluorescent property, advantage and application of the green fluorescent protein was briefly introduced in this paper, aimed to offer the frontier chemistry for the senior chemistry teachers.
Key words senior chemistry; green fluorescent protein; new curriculum standard
Author’s address Institute of Chemistry, Beijing Normal University, Beijing, 100875, China
近年来,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)因其稳定性和独特发光性能而成为在分子生物学、医药学、细胞生物学等领域广泛应用的工具。2008年,瑞典皇家科学院将诺贝尔化学奖授予GFP的发现者和推广者下村修、马丁·查尔菲和钱永健,并将GFP的发现和改造与显微镜的发明相提并论。
1 发光特性
从水母分离出的GFP呈非常稳定的球状结构,显酸性,分子量为27×103 D,含238个氨基酸。GFP是一个生物发光系统,具有激发后能发射荧光的发光色基。它能吸收蓝光(在395 nm具有最大吸收),发射绿色(或黄绿色)荧光,最大发射波长509 nm,并在470 nm处有一肩峰。只有完整的GFP分子才会产生生物荧光,切断的GFP(即使只切掉C、N末端的少数几个氨基酸)丧失发光能力[1,2]。
3 生色团与发光[3-6]
生色团是GFP发出荧光的物质基础,位于64～69位氨基酸。第65位丝氨酸(Ser65)—第66位脱氢酪氨酸(Tyr66)—第67位甘氨酸(Gly67)通过共价键形成对羟苯甲基咪唑环酮,形成一个相当稳定的环状三肽,构成生色团的核心,如图2所示。
生色团通过细胞内多种物质的作用或自催化作用都能产生,不受种属的限制。它非常稳定,不易变性,用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。处理后当pH值恢复中性或除去变性物时,其荧光又会恢复到变性前水平。生色团之间通过共价键结合。
早已发现生色团核心的形成是一个自催化过程,唯一的外部要求是存在分子氧,据此推断β罐结构很可能是生色团形成的至关重要条件。β罐既对生色团起保护作用,又为其形成提供合适的反应空间。其中,Ser65的羰基碳与Gly67的酰胺氮之间的距离明显比开环条件下短很多,这有利于内环的形成。
生色团的形成机理目前尚不十分清楚,一种可能的自催化形成机理如图3所示。生色团的形成大致经过环化、脱水和氧化3个过程。在β罐中,Ser65的羰基碳与Gly67的酰胺氮之间成键环化(I→Ⅱ),并发生氢转移(Ⅱ→Ⅲ)和脱去水分子(Ⅲ→Ⅳ),然后通过氧化形成稳定的环状三肽(Ⅳ→Ⅴ)。这时形成的GFP(Ⅴ)虽然也具有和发光GFP相同的凝胶电泳行为,但不能发光。必须在分子氧存在的情况下,Tyr66由质子化状态(酚羟基)脱氢转变成脱质子态(酚盐,Ⅴ→Ⅵ),GFP才能发光。原因是酸性酚的激发态远大于其基态,只有脱质子态的能级才能匹配。
4 优点[1,2,7]
4.1 易于检测GFP只需紫外光或蓝光激发,即可发出用荧光显微镜甚至肉眼就可观察到的绿色荧光,且灵敏度高,可识别单细胞水平的表达,还可定量检测。它对活细胞基本无毒害,可以很方便地进行活体观察。
4.2 荧光稳定GFP荧光强度高、稳定性高,无光漂白现象,在pH值7～12范围内都可以正常发光,温度超过65 ℃时才会变性使荧光消失,也能耐受长时间光照。
4.3 广谱性GFP的表达几乎不受种属的限制,在微生物、植物、动物中都获得成功的表达。也不受细胞种类和位置的限制,在各个部位都可以表达,在多种原核和真核生物细胞中都可表达发光。
4.4 易于载体构建GFP较小,编码GFP的基因序列也较短,可以很方便地同其他序列一起构建多种质粒,不至于使质粒过大影响转化频率。野生型的GFP在某些植物和动物中表达很弱,可通过更换生色团氨基酸、改变碱基组分、除去内含子、更换强启动子等方法加强表达。替换一些氨基酸可产生不同颜色的光,以适应不同研究的需要。
4.5 可进行活细胞定时定位观察借助于近年激光扫描共聚焦显微镜和强大的计算机软件,可进行三维显示,通过GFP可实时观察到外界信号刺激下目的蛋白的变化过程,使对活细胞中蛋白功能的研究更接近自然状态。
5 应用[1,2,5,8]
5.1 用作报告基因和细胞标记最多和最成功的应用是GFP同宿主蛋白构成融合子来监测宿主蛋白的定位和最后归宿,既能发出荧光又有宿主蛋白正常功能和定位的融合蛋白效果最佳。GFP可融合于宿主蛋白的N端或C端,也可插入其内部。至今GFP已成功靶入大部分细胞器中,如质膜、细胞核、内质网、高尔基体、分泌小体、线粒体、液泡和吞噬体等。
5.2 研究活细胞的蛋白变化过程、细胞器动力学和内膜运输通过GFP可研究某一蛋白在活细胞中的动态变化,药物对蛋白功能影响的动态过程以及蛋白之间的相互作用,免除提纯蛋白、标记上荧光染料、用显微注射导入细胞的复杂操作,并可对信号转导系统的某一蛋白进行动态跟踪,研究其分子机制。
5.3 计算细胞生长速度在高水平组合型表达GFP的细胞品系中,在细胞生长的对数期,GFP发出的荧光信号与细胞的数量密切相关,可将荧光强度转换成细胞浓度。
5.4 临床诊断和基因治疗研究GFP标记的抗原或抗体可作为一种简便、快速的免疫诊断新技术。例如,利用基因工程技术表达的GFP HB Ve抗原融合蛋白兼有荧光和抗原活性,实现用GFP标记肝炎病毒抗原的目标。肿瘤的基因治疗中用GFP作为标记基因,不但可以直接通过FITC系统观察到基因转化,而且可直接收集转化细胞供试验,大大缩短筛选时间。
6 展望[1,2,5]
目前GFP的基础理论研究远不如应用研究,应用中也存在许多问题。例如:荧光强度的非线性性质使其定量非常困难;新生GFP折叠和加工成为具有荧光活性形式的过程十分缓慢,某些快速过程如转录的激活过程还难以用该法进行研究;紫外激发对某些GFP有光漂白和光破坏作用,导致荧光信号快速丧失;多数生物具有微弱的自发荧光现象,并有着类似的激发和发射波长,这会影响某些GFP的检测。随着生物技术的发展,随着GFP的基础理论研究的深入,这些问题终将得到解决。GFP一定可以为人们揭开生命科学中许多至今还不为人知的秘密。
参考文献
[1]唐孝青,等.绿色荧光蛋白及其应用的研究进展[J].陕西农业科学,2007(1):123-124
[2]何海健,等.绿色荧光蛋白及其在分子生物学上的应用[J].金华职业技术学院学报,2008,8(4):27-29
[3]赵华,等.绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学研究中的应用[J].植物生理学通讯,2003,39(2):171-178
[4]Zimmer M.GreenFluorescentProtein(GFP): Applications,Structure, and Related Photo physicalBehavior[J].Chem. Rev.,2002,102(3):759-782
[5]刘祖强,等.绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究[J].武汉大学学报:自然科学版,2000,46(2):211-214
[6]Barondeau D P,et al.Understanding GFP Chromophore Biosynthesis:Controlling Backbone Cyclization andModifying Post-translational Chemistry[J].Biochemistry,2005,44(6):1 960-1 970
[7]郑玥婷.绿色荧光蛋白的原核表达、纯化以及抗体制备[J].氨基酸和生物资源,2005,27(1):40-43
[8]岳莉莉,等.用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统高效表达绿色荧光蛋白标记的HB Ve抗原[J].病毒学报,1998,14(3):234-239
关键词 高中化学;绿色荧光蛋白;新课标
中图分类号:G633.8 文献标识码:B 文章编号:1671-489X(2009)24-0030-02
Introduction of Green Fluorescent Protein: To Help Implementation of New Curriculum Standard//Liu Xiaocui, Wang Mingzhao
Abstract The structure, chromophore, fluorescent property, advantage and application of the green fluorescent protein was briefly introduced in this paper, aimed to offer the frontier chemistry for the senior chemistry teachers.
Key words senior chemistry; green fluorescent protein; new curriculum standard
Author’s address Institute of Chemistry, Beijing Normal University, Beijing, 100875, China
近年来,绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)因其稳定性和独特发光性能而成为在分子生物学、医药学、细胞生物学等领域广泛应用的工具。2008年,瑞典皇家科学院将诺贝尔化学奖授予GFP的发现者和推广者下村修、马丁·查尔菲和钱永健,并将GFP的发现和改造与显微镜的发明相提并论。
1 发光特性
从水母分离出的GFP呈非常稳定的球状结构,显酸性,分子量为27×103 D,含238个氨基酸。GFP是一个生物发光系统,具有激发后能发射荧光的发光色基。它能吸收蓝光(在395 nm具有最大吸收),发射绿色(或黄绿色)荧光,最大发射波长509 nm,并在470 nm处有一肩峰。只有完整的GFP分子才会产生生物荧光,切断的GFP(即使只切掉C、N末端的少数几个氨基酸)丧失发光能力[1,2]。
3 生色团与发光[3-6]
生色团是GFP发出荧光的物质基础,位于64～69位氨基酸。第65位丝氨酸(Ser65)—第66位脱氢酪氨酸(Tyr66)—第67位甘氨酸(Gly67)通过共价键形成对羟苯甲基咪唑环酮,形成一个相当稳定的环状三肽,构成生色团的核心,如图2所示。
生色团通过细胞内多种物质的作用或自催化作用都能产生,不受种属的限制。它非常稳定,不易变性,用酸、碱处理或者加入盐酸胍都不会使它失去荧光。处理后当pH值恢复中性或除去变性物时,其荧光又会恢复到变性前水平。生色团之间通过共价键结合。
早已发现生色团核心的形成是一个自催化过程,唯一的外部要求是存在分子氧,据此推断β罐结构很可能是生色团形成的至关重要条件。β罐既对生色团起保护作用,又为其形成提供合适的反应空间。其中,Ser65的羰基碳与Gly67的酰胺氮之间的距离明显比开环条件下短很多,这有利于内环的形成。
生色团的形成机理目前尚不十分清楚,一种可能的自催化形成机理如图3所示。生色团的形成大致经过环化、脱水和氧化3个过程。在β罐中,Ser65的羰基碳与Gly67的酰胺氮之间成键环化(I→Ⅱ),并发生氢转移(Ⅱ→Ⅲ)和脱去水分子(Ⅲ→Ⅳ),然后通过氧化形成稳定的环状三肽(Ⅳ→Ⅴ)。这时形成的GFP(Ⅴ)虽然也具有和发光GFP相同的凝胶电泳行为,但不能发光。必须在分子氧存在的情况下,Tyr66由质子化状态(酚羟基)脱氢转变成脱质子态(酚盐,Ⅴ→Ⅵ),GFP才能发光。原因是酸性酚的激发态远大于其基态,只有脱质子态的能级才能匹配。
4 优点[1,2,7]
4.1 易于检测GFP只需紫外光或蓝光激发,即可发出用荧光显微镜甚至肉眼就可观察到的绿色荧光,且灵敏度高,可识别单细胞水平的表达,还可定量检测。它对活细胞基本无毒害,可以很方便地进行活体观察。
4.2 荧光稳定GFP荧光强度高、稳定性高,无光漂白现象,在pH值7～12范围内都可以正常发光,温度超过65 ℃时才会变性使荧光消失,也能耐受长时间光照。
4.3 广谱性GFP的表达几乎不受种属的限制,在微生物、植物、动物中都获得成功的表达。也不受细胞种类和位置的限制,在各个部位都可以表达,在多种原核和真核生物细胞中都可表达发光。
4.4 易于载体构建GFP较小,编码GFP的基因序列也较短,可以很方便地同其他序列一起构建多种质粒,不至于使质粒过大影响转化频率。野生型的GFP在某些植物和动物中表达很弱,可通过更换生色团氨基酸、改变碱基组分、除去内含子、更换强启动子等方法加强表达。替换一些氨基酸可产生不同颜色的光,以适应不同研究的需要。
4.5 可进行活细胞定时定位观察借助于近年激光扫描共聚焦显微镜和强大的计算机软件,可进行三维显示,通过GFP可实时观察到外界信号刺激下目的蛋白的变化过程,使对活细胞中蛋白功能的研究更接近自然状态。
5 应用[1,2,5,8]
5.1 用作报告基因和细胞标记最多和最成功的应用是GFP同宿主蛋白构成融合子来监测宿主蛋白的定位和最后归宿,既能发出荧光又有宿主蛋白正常功能和定位的融合蛋白效果最佳。GFP可融合于宿主蛋白的N端或C端,也可插入其内部。至今GFP已成功靶入大部分细胞器中,如质膜、细胞核、内质网、高尔基体、分泌小体、线粒体、液泡和吞噬体等。
5.2 研究活细胞的蛋白变化过程、细胞器动力学和内膜运输通过GFP可研究某一蛋白在活细胞中的动态变化,药物对蛋白功能影响的动态过程以及蛋白之间的相互作用,免除提纯蛋白、标记上荧光染料、用显微注射导入细胞的复杂操作,并可对信号转导系统的某一蛋白进行动态跟踪,研究其分子机制。
5.3 计算细胞生长速度在高水平组合型表达GFP的细胞品系中,在细胞生长的对数期,GFP发出的荧光信号与细胞的数量密切相关,可将荧光强度转换成细胞浓度。
5.4 临床诊断和基因治疗研究GFP标记的抗原或抗体可作为一种简便、快速的免疫诊断新技术。例如,利用基因工程技术表达的GFP HB Ve抗原融合蛋白兼有荧光和抗原活性,实现用GFP标记肝炎病毒抗原的目标。肿瘤的基因治疗中用GFP作为标记基因,不但可以直接通过FITC系统观察到基因转化,而且可直接收集转化细胞供试验,大大缩短筛选时间。
6 展望[1,2,5]
目前GFP的基础理论研究远不如应用研究,应用中也存在许多问题。例如:荧光强度的非线性性质使其定量非常困难;新生GFP折叠和加工成为具有荧光活性形式的过程十分缓慢,某些快速过程如转录的激活过程还难以用该法进行研究;紫外激发对某些GFP有光漂白和光破坏作用,导致荧光信号快速丧失;多数生物具有微弱的自发荧光现象,并有着类似的激发和发射波长,这会影响某些GFP的检测。随着生物技术的发展,随着GFP的基础理论研究的深入,这些问题终将得到解决。GFP一定可以为人们揭开生命科学中许多至今还不为人知的秘密。
参考文献
[1]唐孝青,等.绿色荧光蛋白及其应用的研究进展[J].陕西农业科学,2007(1):123-124
[2]何海健,等.绿色荧光蛋白及其在分子生物学上的应用[J].金华职业技术学院学报,2008,8(4):27-29
[3]赵华,等.绿色荧光蛋白及其在植物分子生物学研究中的应用[J].植物生理学通讯,2003,39(2):171-178
[4]Zimmer M.GreenFluorescentProtein(GFP): Applications,Structure, and Related Photo physicalBehavior[J].Chem. Rev.,2002,102(3):759-782
[5]刘祖强,等.绿色荧光蛋白的结构、发光机制及其应用研究[J].武汉大学学报:自然科学版,2000,46(2):211-214
[6]Barondeau D P,et al.Understanding GFP Chromophore Biosynthesis:Controlling Backbone Cyclization andModifying Post-translational Chemistry[J].Biochemistry,2005,44(6):1 960-1 970
[7]郑玥婷.绿色荧光蛋白的原核表达、纯化以及抗体制备[J].氨基酸和生物资源,2005,27(1):40-43
[8]岳莉莉,等.用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统高效表达绿色荧光蛋白标记的HB Ve抗原[J].病毒学报,1998,14(3):234-239