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摘 要：以大蒜未受精子房为试材，研究基因型、子房发育时期、低温预处理、短期热激处理对大蒜未受精子房愈伤组织诱导的影响。结果表明，在B5+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA培养基上培养的6个大蒜品种中，糙蒜品种子房愈伤组织的诱导率最高；开花当天为最佳诱导时期；低温4℃处理4 d诱导效果最佳；35℃热激处理48 h可显著提高愈伤组织诱导率，但热激处理易使材料发生褐化，褐化率均在60%以上。
关键词：大蒜；未受精子房；愈伤组织；基因型；温度
大蒜是中国传统出口蔬菜产品，在国际市场上享有极高信誉，产品多年畅销不衰[1，2]。随着技术贸易壁垒的日益显现，对大蒜品质的要求越来越高[3]，但由于大蒜多采用无性方式繁殖，病毒逐代积累，容易导致品种种性退化[4]，为此，采取有效措施尽快培育出适合国际市场需求的大蒜新品种势在必行。
利用作物未受精胚珠或子房进行离体培养诱导雌核发育，可获得单倍体或双单倍体植株，进而获得纯合系[5]。单倍体可用来部分固定杂种优势，扩大可利用的基因资源，加快育种进程[6]。与花药培养一样，利用子房进行离体培养诱导雌配子体产生单倍体植株在单倍体育种上具有重要意义[7]。20世纪70～80年代，Uchimiya等（1971）利用未传粉的玉米（Zea mays L.）子房和茄子（Solanum melongena L.）胚珠诱导出愈伤组织，并观察到其中有单倍体细胞的分裂，表明雌配子体人工诱导单倍体植株是可能的[8]。在蔬菜雌核诱导单倍体的研究中，黄瓜和西葫芦的未受精胚珠培养技术已较为成熟[9]。葱属植物中已从洋葱[10～12]、韭菜[13]、百合[14]未授粉子房或胚珠培养出单倍体植株。关于大蒜未受精胚珠与子房培养的研究尚未见报道。本试验旨在通过研究大蒜基因型、子房发育时期、温度等因子对未受精子房离体培养的影响，优化大蒜子房离体培养技术体系，为建立高效大蒜未受精子房离体培养再生植株技术提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验大蒜取自山东农业大学园艺科技创新园。
1.2 试验方法
1.2.1 大蒜未受精子房离体培养 切取田间生长中后期的蒜薹，流水冲洗1～2 h，75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗2～3次，4%次氯酸钠消毒35 min，最后用无菌水冲洗3～5次。切去蒜薹最下端并放入装有液体MS培养基（含30 g/L蔗糖）的大试管中培养，4～6 d后，无菌条件下剥除膨大的气生鳞茎继续培养。接种前剥去花瓣及雄蕊，将生长良好、大小一致的子房接种到B5+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA培养基（培养基中添加30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，pH 5.8）中诱导愈伤组织。组培室光照条件为2 600 lx，16 h/d，室温为（25±2）℃。
1.2.2 基因型的影响 选取糙蒜、二水早、蒲棵、正月早、红七星、二秀早6个不同品种的花蕾，在开花前2～3 d，剥除花瓣及雄蕊，获得大蒜子房接种于诱导培养基中，转移至光照组培室培养。
1.2.3 子房发育程度的影响 选取糙蒜、蒲棵、正月早3个品种的花蕾，分别在开花前6～7 d、开花前2～3 d、开花当天将花瓣与雄蕊剥除，获得大蒜子房并接种于诱导培养基中，转移至光照组培室培养。
1.2.4 低温预处理的影响 以糙蒜、正月早两个品种的花蕾为试材，在开花前2～3 d将其移至0～4℃的冰箱中，低温预处理0（CK）、1、2、4、6 d，处理结束后将子房接种到诱导培养基中，转移至光照组培室培养。
1.2.5 热激处理的影响 将糙蒜、正月早两个品种的大蒜子房接种后，置于35℃的恒温培养箱中热激处理0（CK）、12、24、36、48 h，之后移至光照组培室继续培养。
1.3 数据统计
子房接入诱导培养基后，每隔3 d观察一次，60 d后统计愈伤组织形成数。每个处理重复3次，每次接种外植体个数约为50个。试验数据采用DPS 6.55和Excel 2003进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同基因型对愈伤组织形成的影响
由表1可知，在本试验供试的6个材料中，糙蒜、正月早两个品种间差异不显著；红七星、蒲棵、正月早三个品种间差异不显著；二季早、二水早两个品种间差异不显著。其中，子房愈伤组织诱导率最高的为糙蒜，可达11.11%，二水早最低，为0，二者差异极显著。说明基因型对大蒜子房愈伤组织诱导率有一定的影响，基因型不同，子房愈伤组织诱导率不同。
2.2 子房不同发育时期对愈伤组织形成的影响
由表2可知，从未受精子房愈伤组织诱导率来看，3个品种均以开花当天为最高，开花前6～7 d
为最低，二者差异极显著。其中糙蒜、蒲棵开花当天与开花前2～3 d的子房愈伤诱导率没有显著差异，但都显著高于开花前6～7 d的子房愈伤组织诱导率；正月早3个时期的子房愈伤诱导率之间均有显著差异。
2.3 不同低温预处理时间对愈伤组织形成的影响
由表3可知，经4℃低温处理的大蒜未受精子房，在0～4 d内，愈伤组织诱导率随低温时间的延长而增大，超过4 d诱导率下降。低温处理4 d的子房愈伤组织诱导率达到最大，糙蒜和正月早分别为15.65%、11.25%，与不经低温处理的子房愈伤组织诱导率呈极显著差异。由此可见，低温处理能显著提高大蒜未受精子房愈伤组织诱导率。
2.4 不同短期热激处理时间对愈伤组织形成的影响
从表4可以得出，从愈伤组织的诱导率来看，糙蒜经过35℃处理12、24、36 h的子房愈伤组织诱导率略有提高，但与其它两个处理差异不显著；热激处理48 h比未经热激处理的子房愈伤组织诱导率显著提高。正月早经热激处理后诱导率有所提高，其中处理12、24、36 h与未经热激处理的子房愈伤组织诱导率差异不显著；处理48 h比其它处理的子房愈伤组织诱导率显著提高。从外植体的褐化程度来看，未经热激处理与经过热激处理的外植体之间差异极显著，两个品种未经热激处理的外植体均未发现褐化现象，经过热激处理的外植体，随热激时间的增加，褐化率增大，不论热激处理时间长短，褐化率均在60%以上，褐化现象严重。 3 结论
未受精胚珠或子房离体培养诱导雌核发育产生单倍体植株是国内外探索的新课题。本研究显示，大蒜未受精子房离体培养10 d左右子房开始膨大，经过50 d左右子房内部开始形成淡绿色的颗粒状愈伤组织并胀破子房壁，后愈伤组织逐渐膨大变成淡黄色。影响未受精胚珠与子房离体培养的因素很多，如植物的基因型、外植体的发育程度、接种前预处理、培养基、培养条件等[15]。
基因型是影响子房离体培养的重要因素之一。不同的基因型胚状体诱导率差异很大[16]。阎华等在向日葵未受精胚珠培养中观察到不同品种在培养中的差异十分显著[17]。朱献辉研究表明，在辣椒子房培养中不同基因型之间愈伤组织诱导率存在显著差异[18]。多次研究表明，不同基因型洋葱的诱导率差异明显[12，19，20]。在大蒜子房培养中，不同基因型之间也存在较为明显的差异。一般认为，不同基因型之间存在诱导率的差异是受遗传调控的影响。
子房发育时期对于诱导愈伤组织起至关重要的作用。谢冰等对西葫芦未受精胚珠离体培养诱导结果表明，西葫芦成熟以及接近成熟的胚囊对人工诱导条件比较敏感，而成熟后的胚囊成员细胞在离体条件下较难启动分裂[21，22]。陈学军等提出开花当日西葫芦未受精胚珠活力较高，其愈伤组织诱导率也最高[23]。本试验对糙蒜、蒲棵、正月早3个品种研究表明，未受精子房愈伤组织的诱导率与子房发育程度有关，开花当天的子房愈伤组织诱导率最高，分析可能是由于开花当天子房内源激素的浓度较高，利于愈伤组织的诱导。
低温、高温等预处理方式，目的是从生理生化上改变细胞的生理状态、改变其分裂方式和发育途径。前人研究表明，对花蕾或子房进行有效的预处理，能改变胚胎的发育途径，促进胚状体及愈伤组织的形成[24]。Gürel等[25]研究表明，低温处理对甜菜未受精胚珠离体培养起到明显的促进作用。而Metwally等[26]研究表明，不经低温预处理的胚珠愈伤诱导率最高。本研究显示低温（4℃）处理4 d最利于提高大蒜未受精子房愈伤组织诱导率。由此可见，不同植物的子房培养对低温预处理的反应不同。热激处理对子房培养有一定的影响。王璐等[5]研究表明，热激处理有利于提高黄瓜未受精子房培养过程中的雌核诱导率。郭永强[27]、徐静[28]在对西葫芦未受精胚珠雌核诱导的研究中发现，35℃黑暗热激处理5 d对启动西葫芦未受精胚珠雌核发育有效。本试验研究表明，热激处理可提高大蒜子房愈伤组织诱导率，其中35℃处理48 h诱导率明显提高，但热激处理易使材料发生褐化，且时间越长，褐化率越高。分析可能是由于高温处理提高了外植体中多酚氧化酶的活性，促进了多酚物质的氧化。因此，通过热激处理来提高大蒜子房愈伤组织诱导率还有待于进一步研究。
本研究通过分析不同因素对大蒜子房离体培养的影响，优化了愈伤组织诱导条件。但对于各处理下形成的愈伤组织是否能够分化形成再生植株尚不清楚，需要进一步研究。
参 考 文 献：
[1] 苏美琼， 杨柏崇， 成密红， 等. 大蒜的功效及综合利用研究进展[J]. 西北农业学报， 2003， 12（4）： 151-156.
[2] 刘世琦， 付 镛， 王冰林. 大蒜二次生长形成机理研究[J]. 山东农业科学， 2006， 1： 39-42.
[3] 刘世琦. 加入 WTO 对中国大蒜产业的影响[J]. 长江蔬菜， 2003，2：5-7.
[4] 于文艳， 刘世琦， 梁庆玲， 等. 大蒜二倍体与四倍体生长和生理指标的比较研究[J]. 山东农业科学， 2008， 2：42-44， 65.
[5] 王 璐， 陈小燕， 张 力， 等. 不同因素对黄瓜未受精子房胚状体诱导的影响[J]. 西北农业学报， 2008， 17（4）： 267-270.
[6] 李根英， 孟庆华， 隋新霞， 等. 玉米花粉诱导小麦单倍体的研究进展[J]. 山东农业科学， 2003，1：52-55.
[7] 胡适宜. 被子植物胚胎学[M]. 北京： 高等教育出版社， 1983，209-211.
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[11]Campion B， Alloni C. Induction of haploid plants in onion （Allium cepa L.） by in vitro culture of unpollinated ovules[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 1990， 20（1）：1-6.
[12]Geoffriau E， Kahane R， Rancillac M. Variation of gynogenesis ability in onion （Allium cepa L.）[J]. Euphytica， 1997， 94（1）： 37-44.
[13]田惠桥， 杨弘远. 韭菜未传粉子房培养中单倍体的胚胎发生和植株再生[J]. 实验生物学报， 1989， 22（2）： 139-147. [14]谷祝平， 郑国倡. 百合未授粉子房的培养及其胚胎学观察[J]. 植物学报， 1983， 25（1）： 24-27.
[15]伍成厚， 梁承邺. 被子植物未受精胚珠与子房离体培养的研究进展[J]. 热带亚热带植物学报， 2004，12（6）：580-586.
[16]徐文玲， 王翠花， 牟晋华， 等. 大白菜游离小孢子胚状体诱导影响因素的研究[J]. 山东农业科学， 2007，6：8-10.
[17]阎 华， 周 嫦， 杨弘远.向日葵未受精胚珠培养中各种影响因素的实验研究[J].武汉植物学研究， 1988， 6（4）： 319-326.
[18]朱献辉， 巩振辉， 王乾宏， 等. 辣椒未受精子房愈伤组织诱导的研究[J]. 西北农业学报， 2008， 17（5）： 310-316.
[19]Keller J. Culture of unpollinated ovules， ovaries and flower buds in some species of the genus Alllium and haploid induction via gynogenesis in onion （Alllium cepa L.）[J]. Euphytica，1990，47（3）：241-247.
[20]Bohanec B， Jaksc M， Ihan A， et al. Studies of gynogenesis in onion （Alllium cepa L.）： induction procedures and genetic analysis of regenerants [J]. Plant Sci.， 1995，104（2）：215-224.
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[22]谢 冰. 西葫芦的离体雌核发育及植株再生[D]. 泰安： 山东农业大学， 2005.
[23]陈学军， 邢国民， 陈竹君. 西葫芦未授粉胚珠离体培养和植株再生[J]. 浙江农业学报， 2000， 12（3）： 165-167.
[24]李 佳.百合单倍体培养及细胞学观察[D]. 北京： 中国农业科学院， 2011.
关键词：大蒜；未受精子房；愈伤组织；基因型；温度
大蒜是中国传统出口蔬菜产品，在国际市场上享有极高信誉，产品多年畅销不衰[1，2]。随着技术贸易壁垒的日益显现，对大蒜品质的要求越来越高[3]，但由于大蒜多采用无性方式繁殖，病毒逐代积累，容易导致品种种性退化[4]，为此，采取有效措施尽快培育出适合国际市场需求的大蒜新品种势在必行。
利用作物未受精胚珠或子房进行离体培养诱导雌核发育，可获得单倍体或双单倍体植株，进而获得纯合系[5]。单倍体可用来部分固定杂种优势，扩大可利用的基因资源，加快育种进程[6]。与花药培养一样，利用子房进行离体培养诱导雌配子体产生单倍体植株在单倍体育种上具有重要意义[7]。20世纪70～80年代，Uchimiya等（1971）利用未传粉的玉米（Zea mays L.）子房和茄子（Solanum melongena L.）胚珠诱导出愈伤组织，并观察到其中有单倍体细胞的分裂，表明雌配子体人工诱导单倍体植株是可能的[8]。在蔬菜雌核诱导单倍体的研究中，黄瓜和西葫芦的未受精胚珠培养技术已较为成熟[9]。葱属植物中已从洋葱[10～12]、韭菜[13]、百合[14]未授粉子房或胚珠培养出单倍体植株。关于大蒜未受精胚珠与子房培养的研究尚未见报道。本试验旨在通过研究大蒜基因型、子房发育时期、温度等因子对未受精子房离体培养的影响，优化大蒜子房离体培养技术体系，为建立高效大蒜未受精子房离体培养再生植株技术提供参考。
1 材料与方法
1.1 试验材料
本试验大蒜取自山东农业大学园艺科技创新园。
1.2 试验方法
1.2.1 大蒜未受精子房离体培养 切取田间生长中后期的蒜薹，流水冲洗1～2 h，75%酒精消毒30 s，无菌水冲洗2～3次，4%次氯酸钠消毒35 min，最后用无菌水冲洗3～5次。切去蒜薹最下端并放入装有液体MS培养基（含30 g/L蔗糖）的大试管中培养，4～6 d后，无菌条件下剥除膨大的气生鳞茎继续培养。接种前剥去花瓣及雄蕊，将生长良好、大小一致的子房接种到B5+2 mg/L 6-BA+1 mg/L NAA培养基（培养基中添加30 g/L蔗糖和7 g/L琼脂，pH 5.8）中诱导愈伤组织。组培室光照条件为2 600 lx，16 h/d，室温为（25±2）℃。
1.2.2 基因型的影响 选取糙蒜、二水早、蒲棵、正月早、红七星、二秀早6个不同品种的花蕾，在开花前2～3 d，剥除花瓣及雄蕊，获得大蒜子房接种于诱导培养基中，转移至光照组培室培养。
1.2.3 子房发育程度的影响 选取糙蒜、蒲棵、正月早3个品种的花蕾，分别在开花前6～7 d、开花前2～3 d、开花当天将花瓣与雄蕊剥除，获得大蒜子房并接种于诱导培养基中，转移至光照组培室培养。
1.2.4 低温预处理的影响 以糙蒜、正月早两个品种的花蕾为试材，在开花前2～3 d将其移至0～4℃的冰箱中，低温预处理0（CK）、1、2、4、6 d，处理结束后将子房接种到诱导培养基中，转移至光照组培室培养。
1.2.5 热激处理的影响 将糙蒜、正月早两个品种的大蒜子房接种后，置于35℃的恒温培养箱中热激处理0（CK）、12、24、36、48 h，之后移至光照组培室继续培养。
1.3 数据统计
子房接入诱导培养基后，每隔3 d观察一次，60 d后统计愈伤组织形成数。每个处理重复3次，每次接种外植体个数约为50个。试验数据采用DPS 6.55和Excel 2003进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 不同基因型对愈伤组织形成的影响
由表1可知，在本试验供试的6个材料中，糙蒜、正月早两个品种间差异不显著；红七星、蒲棵、正月早三个品种间差异不显著；二季早、二水早两个品种间差异不显著。其中，子房愈伤组织诱导率最高的为糙蒜，可达11.11%，二水早最低，为0，二者差异极显著。说明基因型对大蒜子房愈伤组织诱导率有一定的影响，基因型不同，子房愈伤组织诱导率不同。
2.2 子房不同发育时期对愈伤组织形成的影响
由表2可知，从未受精子房愈伤组织诱导率来看，3个品种均以开花当天为最高，开花前6～7 d
为最低，二者差异极显著。其中糙蒜、蒲棵开花当天与开花前2～3 d的子房愈伤诱导率没有显著差异，但都显著高于开花前6～7 d的子房愈伤组织诱导率；正月早3个时期的子房愈伤诱导率之间均有显著差异。
2.3 不同低温预处理时间对愈伤组织形成的影响
由表3可知，经4℃低温处理的大蒜未受精子房，在0～4 d内，愈伤组织诱导率随低温时间的延长而增大，超过4 d诱导率下降。低温处理4 d的子房愈伤组织诱导率达到最大，糙蒜和正月早分别为15.65%、11.25%，与不经低温处理的子房愈伤组织诱导率呈极显著差异。由此可见，低温处理能显著提高大蒜未受精子房愈伤组织诱导率。
2.4 不同短期热激处理时间对愈伤组织形成的影响
从表4可以得出，从愈伤组织的诱导率来看，糙蒜经过35℃处理12、24、36 h的子房愈伤组织诱导率略有提高，但与其它两个处理差异不显著；热激处理48 h比未经热激处理的子房愈伤组织诱导率显著提高。正月早经热激处理后诱导率有所提高，其中处理12、24、36 h与未经热激处理的子房愈伤组织诱导率差异不显著；处理48 h比其它处理的子房愈伤组织诱导率显著提高。从外植体的褐化程度来看，未经热激处理与经过热激处理的外植体之间差异极显著，两个品种未经热激处理的外植体均未发现褐化现象，经过热激处理的外植体，随热激时间的增加，褐化率增大，不论热激处理时间长短，褐化率均在60%以上，褐化现象严重。 3 结论
未受精胚珠或子房离体培养诱导雌核发育产生单倍体植株是国内外探索的新课题。本研究显示，大蒜未受精子房离体培养10 d左右子房开始膨大，经过50 d左右子房内部开始形成淡绿色的颗粒状愈伤组织并胀破子房壁，后愈伤组织逐渐膨大变成淡黄色。影响未受精胚珠与子房离体培养的因素很多，如植物的基因型、外植体的发育程度、接种前预处理、培养基、培养条件等[15]。
基因型是影响子房离体培养的重要因素之一。不同的基因型胚状体诱导率差异很大[16]。阎华等在向日葵未受精胚珠培养中观察到不同品种在培养中的差异十分显著[17]。朱献辉研究表明，在辣椒子房培养中不同基因型之间愈伤组织诱导率存在显著差异[18]。多次研究表明，不同基因型洋葱的诱导率差异明显[12，19，20]。在大蒜子房培养中，不同基因型之间也存在较为明显的差异。一般认为，不同基因型之间存在诱导率的差异是受遗传调控的影响。
子房发育时期对于诱导愈伤组织起至关重要的作用。谢冰等对西葫芦未受精胚珠离体培养诱导结果表明，西葫芦成熟以及接近成熟的胚囊对人工诱导条件比较敏感，而成熟后的胚囊成员细胞在离体条件下较难启动分裂[21，22]。陈学军等提出开花当日西葫芦未受精胚珠活力较高，其愈伤组织诱导率也最高[23]。本试验对糙蒜、蒲棵、正月早3个品种研究表明，未受精子房愈伤组织的诱导率与子房发育程度有关，开花当天的子房愈伤组织诱导率最高，分析可能是由于开花当天子房内源激素的浓度较高，利于愈伤组织的诱导。
低温、高温等预处理方式，目的是从生理生化上改变细胞的生理状态、改变其分裂方式和发育途径。前人研究表明，对花蕾或子房进行有效的预处理，能改变胚胎的发育途径，促进胚状体及愈伤组织的形成[24]。Gürel等[25]研究表明，低温处理对甜菜未受精胚珠离体培养起到明显的促进作用。而Metwally等[26]研究表明，不经低温预处理的胚珠愈伤诱导率最高。本研究显示低温（4℃）处理4 d最利于提高大蒜未受精子房愈伤组织诱导率。由此可见，不同植物的子房培养对低温预处理的反应不同。热激处理对子房培养有一定的影响。王璐等[5]研究表明，热激处理有利于提高黄瓜未受精子房培养过程中的雌核诱导率。郭永强[27]、徐静[28]在对西葫芦未受精胚珠雌核诱导的研究中发现，35℃黑暗热激处理5 d对启动西葫芦未受精胚珠雌核发育有效。本试验研究表明，热激处理可提高大蒜子房愈伤组织诱导率，其中35℃处理48 h诱导率明显提高，但热激处理易使材料发生褐化，且时间越长，褐化率越高。分析可能是由于高温处理提高了外植体中多酚氧化酶的活性，促进了多酚物质的氧化。因此，通过热激处理来提高大蒜子房愈伤组织诱导率还有待于进一步研究。
本研究通过分析不同因素对大蒜子房离体培养的影响，优化了愈伤组织诱导条件。但对于各处理下形成的愈伤组织是否能够分化形成再生植株尚不清楚，需要进一步研究。
参 考 文 献：
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[13]田惠桥， 杨弘远. 韭菜未传粉子房培养中单倍体的胚胎发生和植株再生[J]. 实验生物学报， 1989， 22（2）： 139-147. [14]谷祝平， 郑国倡. 百合未授粉子房的培养及其胚胎学观察[J]. 植物学报， 1983， 25（1）： 24-27.
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[16]徐文玲， 王翠花， 牟晋华， 等. 大白菜游离小孢子胚状体诱导影响因素的研究[J]. 山东农业科学， 2007，6：8-10.
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