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【摘 要】目的： 研制人血清中促甲状腺素（TSH）的化学发光免疫检测试剂盒。方法： 采用辣根过氧化物酶标记的抗TSHβ亚单位特异性单克隆抗体（mAb）， 与固相包被的抗TSHα亚单位的另一mAb配对， 以鲁米诺作为底物， 采用两步法建立了双位点夹心法人血清TSH的化学发光免疫定量分析法。结果： 该方法灵敏度为0.0788 mIU/L， 批内CV平均为4.7%， 批间CV平均为8.4%， 平均回收率为93.05%。该检测与LH、 FSH和HCG无交叉反应。
【关键词】促甲状腺激素（TSH）；化学发光免疫分析法；试剂盒
甲状腺功能改变时， TSH的波动较甲状腺激素更迅速且明显， 是反映下丘脑、垂体、甲状腺轴功能的敏感指标， 因此采用灵敏度高的TSH免疫分析法具有重要的意义。化学发光免疫分析（chemiluminescent immunoassay， CLIA）是一种灵敏的免疫分析方法， 在免疫诊断试剂研制中已得到了广泛的应用[3]。本研究根据化学发光免疫分析法的原理研制了血清TSH的检测试剂盒， 与国内外同类产品相比具有简便、快捷、成本低等优点。
1 材料和方法
1.1 材料 TSH单克隆抗体（mAb）、 TSH标准品抗原和辣根过氧化物酶（HRP）为Sigma公司产品， 光免板为Thermo Electron公司产品， 化学发光底物为BioRad公司产品。
1.2 方法
1.2.1 标准品的配制 将TSH抗原标定后溶于小牛血清中， 配制成含0.1， 1， 5， 20， 100 mIU/L的标准溶液。
1.2.2 抗体包被板的制备 将100μL含TSH mAb（0.5mg/L）的pH9.6碳酸盐缓冲液加至包被板中， 37℃包被2 h， 再用含10 mg/L BSA的0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液于37℃封闭2 h后晾干备用。
1.2.3 酶标记物的制备 TSH的酶标记物采用过碘酸钠法制备， 然后经0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液透析过夜后， 加入等量的甘油于-20℃保存备用。
1.2.4 检测方法 将50 μL待测样品或标准品加入包被TSH的光免板中， 37℃温育30 min， 弃反应液， 用洗涤液（含0.5 mg/L Tween20的0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液）洗5次， 加酶标记物50 μL， 37℃温育30 min后同样用洗涤液洗5次， 然后加入发光底物于5～10 min内测定各孔的发光值RLU。样本中的TSH浓度依据由标准品TSH浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量。
2 结果
2.1 动力学性质 在HRP鲁米诺H2O2发光体系中， 将不同量的免疫复合物加入发光液中， 发光强度（RLU）随反应时间而变化。10 min后RLU接近峰值， 在5～15 min内RLU较为稳定， 随后开始缓慢下降。
2.2 反应条件优化
2.2.1 加样量对RLU的影响 样本和酶标记物的加样量分别为50μL和100μL考查标准品（0、0.1、1、5、20、100 mIU/L）RLU， 发现加样量为100μL与50μL RLU相差不大， 说明50 μL的加样量反应能达到平衡。
2.2.2 反应模式对RLU的影响 采用二步法。第一步： 加入标准品和待测样品后， 将反应体系在37℃分别温育15、30、45、60 min； 第二步： 加入酶标记抗体后， 将反应体系在37℃分别温育15、30、45、60 min。结果表明温育时间为30 min时反应皆能达到平衡。
A： 第一步温育时间对RLU的影响； B： 第二步温育时间对RLU的影响.
2.3 稳定性 将试剂盒放置于37℃ 6 d后， 比较与放置前参考标准品各点RLU值， 参考标准品各点RLU值未见明显降低， 且本底发光值无明显升高， 表明试剂盒标准曲线无明显漂移， 满足稳定性要求。
2.4 方法学评价
2.4.1 标准曲线与灵敏度 在设定的免疫反应和发光条件下， 以标准血清的浓度（0～100 mIU/L）制作的标准曲线见图3。同时测定20个零标准， 用零标准均值加上2倍标准差， 计算出此方法的灵敏度为0.0788 mIU/L。
2.4.2 精密度 取低（4.44 mIU/L）、中（19.45 mIU/L）和高（79.23 mIU/L）3种TSH浓度各重复测定10次， 测定批内CV分别为6.2%、3.3%和4.6%，平均为4.7%。隔日分别进行5次独立试验， 测批间CV分别为8.3%、7.6%和9.3%， 平均为8.4%。
2.4.3 准确性 在已知TSH浓度的血清中加入3种不同浓度的标准血清，测定加入回收率为93.05%。将TSH浓度为44.42 mIU/L的血清用标准零血清分别按1/2、1/4、1/8、1/16稀释， 测量各稀释浓度的TSH含量， 测定稀释回收率为99.86%。
2.4.4 特异性 在已知浓度的血清样品中加入不同浓度的LH、FSH和HCG后， 对TSH的测定无干扰。
2.4.5 与进口试剂的比较 将研制的TSH CLIA定量检测试剂盒与Abbott architect i2000全自动化学发光系统共同对30例正常人、20例甲亢及80例甲低臨床标本进行检测， 通过数据分析， 得出两个检测系统所得数值具有明显相关性。
3 讨论
血清促甲状腺素定量检测的方法主要有放射免疫法、 酶联免疫法、 时间分辨荧光免疫法和化学发光免疫法等几种[4]。考虑到目前化学发光和时间分辨荧光分析仪器几乎全部为国外厂商生产， 而绝大多数厂商采用仪器加试剂盒捆绑销售的垄断模式， 并在仪器中人为设置排它性检测程序， 从而抬高了配套试剂盒价格， 增加了检测成本， 所以本工作旨在开发国产低价、 稳定、 通用的人血TSH CLIA试剂盒。首先对读数时间进行了动力学研究， 发现其在5～15 min内RLU处于平台期，反应时间选择10 min。其次对反应条件进行了实验摸索， 在不同的温育时间和加样量的条件下， 各RLU值相差不大， 因此选择了50 μL的加样量与两步共1 h的反应时间。
我们研制的TSH化学发光免疫测定试剂盒通过方法学鉴定表明无论是灵敏度、 准确性、 特异性等技术指标均达到了临床诊断的要求[5]； 同时该方法具有操作方便， 反应时间短和成本低等优点， 具有较广阔的市场应用前景。
【关键词】促甲状腺激素（TSH）；化学发光免疫分析法；试剂盒
甲状腺功能改变时， TSH的波动较甲状腺激素更迅速且明显， 是反映下丘脑、垂体、甲状腺轴功能的敏感指标， 因此采用灵敏度高的TSH免疫分析法具有重要的意义。化学发光免疫分析（chemiluminescent immunoassay， CLIA）是一种灵敏的免疫分析方法， 在免疫诊断试剂研制中已得到了广泛的应用[3]。本研究根据化学发光免疫分析法的原理研制了血清TSH的检测试剂盒， 与国内外同类产品相比具有简便、快捷、成本低等优点。
1 材料和方法
1.1 材料 TSH单克隆抗体（mAb）、 TSH标准品抗原和辣根过氧化物酶（HRP）为Sigma公司产品， 光免板为Thermo Electron公司产品， 化学发光底物为BioRad公司产品。
1.2 方法
1.2.1 标准品的配制 将TSH抗原标定后溶于小牛血清中， 配制成含0.1， 1， 5， 20， 100 mIU/L的标准溶液。
1.2.2 抗体包被板的制备 将100μL含TSH mAb（0.5mg/L）的pH9.6碳酸盐缓冲液加至包被板中， 37℃包被2 h， 再用含10 mg/L BSA的0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液于37℃封闭2 h后晾干备用。
1.2.3 酶标记物的制备 TSH的酶标记物采用过碘酸钠法制备， 然后经0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液透析过夜后， 加入等量的甘油于-20℃保存备用。
1.2.4 检测方法 将50 μL待测样品或标准品加入包被TSH的光免板中， 37℃温育30 min， 弃反应液， 用洗涤液（含0.5 mg/L Tween20的0.01 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液）洗5次， 加酶标记物50 μL， 37℃温育30 min后同样用洗涤液洗5次， 然后加入发光底物于5～10 min内测定各孔的发光值RLU。样本中的TSH浓度依据由标准品TSH浓度和对应的RLU建立的数学模型进行定量。
2 结果
2.1 动力学性质 在HRP鲁米诺H2O2发光体系中， 将不同量的免疫复合物加入发光液中， 发光强度（RLU）随反应时间而变化。10 min后RLU接近峰值， 在5～15 min内RLU较为稳定， 随后开始缓慢下降。
2.2 反应条件优化
2.2.1 加样量对RLU的影响 样本和酶标记物的加样量分别为50μL和100μL考查标准品（0、0.1、1、5、20、100 mIU/L）RLU， 发现加样量为100μL与50μL RLU相差不大， 说明50 μL的加样量反应能达到平衡。
2.2.2 反应模式对RLU的影响 采用二步法。第一步： 加入标准品和待测样品后， 将反应体系在37℃分别温育15、30、45、60 min； 第二步： 加入酶标记抗体后， 将反应体系在37℃分别温育15、30、45、60 min。结果表明温育时间为30 min时反应皆能达到平衡。
A： 第一步温育时间对RLU的影响； B： 第二步温育时间对RLU的影响.
2.3 稳定性 将试剂盒放置于37℃ 6 d后， 比较与放置前参考标准品各点RLU值， 参考标准品各点RLU值未见明显降低， 且本底发光值无明显升高， 表明试剂盒标准曲线无明显漂移， 满足稳定性要求。
2.4 方法学评价
2.4.1 标准曲线与灵敏度 在设定的免疫反应和发光条件下， 以标准血清的浓度（0～100 mIU/L）制作的标准曲线见图3。同时测定20个零标准， 用零标准均值加上2倍标准差， 计算出此方法的灵敏度为0.0788 mIU/L。
2.4.2 精密度 取低（4.44 mIU/L）、中（19.45 mIU/L）和高（79.23 mIU/L）3种TSH浓度各重复测定10次， 测定批内CV分别为6.2%、3.3%和4.6%，平均为4.7%。隔日分别进行5次独立试验， 测批间CV分别为8.3%、7.6%和9.3%， 平均为8.4%。
2.4.3 准确性 在已知TSH浓度的血清中加入3种不同浓度的标准血清，测定加入回收率为93.05%。将TSH浓度为44.42 mIU/L的血清用标准零血清分别按1/2、1/4、1/8、1/16稀释， 测量各稀释浓度的TSH含量， 测定稀释回收率为99.86%。
2.4.4 特异性 在已知浓度的血清样品中加入不同浓度的LH、FSH和HCG后， 对TSH的测定无干扰。
2.4.5 与进口试剂的比较 将研制的TSH CLIA定量检测试剂盒与Abbott architect i2000全自动化学发光系统共同对30例正常人、20例甲亢及80例甲低臨床标本进行检测， 通过数据分析， 得出两个检测系统所得数值具有明显相关性。
3 讨论
血清促甲状腺素定量检测的方法主要有放射免疫法、 酶联免疫法、 时间分辨荧光免疫法和化学发光免疫法等几种[4]。考虑到目前化学发光和时间分辨荧光分析仪器几乎全部为国外厂商生产， 而绝大多数厂商采用仪器加试剂盒捆绑销售的垄断模式， 并在仪器中人为设置排它性检测程序， 从而抬高了配套试剂盒价格， 增加了检测成本， 所以本工作旨在开发国产低价、 稳定、 通用的人血TSH CLIA试剂盒。首先对读数时间进行了动力学研究， 发现其在5～15 min内RLU处于平台期，反应时间选择10 min。其次对反应条件进行了实验摸索， 在不同的温育时间和加样量的条件下， 各RLU值相差不大， 因此选择了50 μL的加样量与两步共1 h的反应时间。
我们研制的TSH化学发光免疫测定试剂盒通过方法学鉴定表明无论是灵敏度、 准确性、 特异性等技术指标均达到了临床诊断的要求[5]； 同时该方法具有操作方便， 反应时间短和成本低等优点， 具有较广阔的市场应用前景。