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[摘要] 目的 探讨雌激素对兔脊髓缺血再灌注损伤的神经保护效应。 方法 成年新西兰大白兔肾下腹主动脉钳夹20min恢复再灌注。实验分组如下：Control组（n=8）仅行肾下腹主动脉钳夹20min恢复再灌注；Sham组（n=8）行对照组操作除外肾下腹主动脉钳夹；雌激素处理组（n=8）分别在再灌注开始即刻经兔耳缘静脉给予雌激素200，400，800μg/kg。再灌注后48h进行下肢神经功能评分（Tarlov法）后处死受试动物，取脊髓行组织HE染色切片病理分析。 结果 Tarlov评分发现雌激素处理组神经功能评分明显高于control组（P<0.05）。组织病理分析可见脊髓前角运动神经元凋亡，坏死较明显。雌激素处理组脊髓前角运动神经元计数明显多于Control组（P<0.01）。 结论 兔脊髓缺血后静脉给予雌激素可明显改善下肢神经功能，增加脊髓前角正常运动神经元数量，减轻缺血再灌注损伤。
[关键词] 雌激素；缺血再灌注；神经保护
[中图分类号] R318.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）23-35-04
脊髓手术或腹主动脉瘤等因术中阻断动脉，可能引起不同程度的脊髓缺血，或表现为神经功能一过性障碍，严重者则出现急性或迟发性截瘫。寻找有效的防治方法是目前研究的热点难点[1-5]。以前的研究证实了雌激素可减轻老年性痴呆、帕金森病和脑中风预后[6-9]，而有关其在脊髓缺血再灌注损伤的保护作用报道甚少。本实验目的旨在探讨雌激素在兔脊髓缺血再灌注损伤中的保护作用及其可能机制，并对其最佳使用剂量作一初步研究，为其在临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 一般资料
雄性新西兰大白兔40只，体质量2.0～2.5kg，购自上海生旺实验动物养殖场（合格证号：2007000700025），随机分为5组，每组8只。对照组（Control组）行单纯肾下腹主动脉阻闭20min，再灌注48h；假手术组（Sham组）行单纯手术操作不阻闭肾下腹主动脉；雌激素处理E1组（E1组）、雌激素处理E2组（E2组）、雌激素处理E3组（E3组），行肾下腹主动脉阻闭20min，再灌注开始即刻经耳缘静脉分别给予雌激素200，400，800μg/kg。
1.2 方法
所有动物实验前晚禁食，不限制饮水。实验前予20g/L戊巴比妥钠（40mg/kg）经兔耳缘静脉进行麻醉。术中使用复方乳酸钠4mL/（kg·h）静脉维持。行股动脉穿刺，接压力传感器监测股动脉压，并从压力波形读取脉率（PR）。自肛门放入温度探头持续监测肛温，术中维持肛温于38.0～39.0℃。选取缺血前、缺血10min以及再灌注10min抽取动脉血样测定PaO2，PaCO2，pH等。
1.2.1 脊髓缺血模型制作 参照文献及本实验室以往所采用的方法[10-12]，取腹正中切口，自剑突下两指剪开皮肤、腹膜，暴露左侧肾脏及腹主动脉，选取左肾动脉分支下0.8cm处阻闭腹主动脉，阻闭20min后恢复再灌注。动脉阻闭以股动脉压力波形消失，远端动脉压力监测值MAP≤10mm Hg为阻闭成功。开放时则以股动脉压力波形恢复为准。
1.2.2 后肢运动功能评分 手术结束后将动物放回笼中进行单独饲养观察，自由饮食。再灌注后48h，由一名不了解分组情况的观察者进行后肢运动功能评分，评分方法采用修正Tarlov标准：4分，后肢功能完全恢复，能正常行走；3分，可站立但无法行走；2分，后肢可自由活动但无法站立；1分，有可觉察的关节自主活动；0分，没有可觉察的下肢活动。
1.2.3 病理学观察 所有动物在再灌注48h神经功能评分结束后，静脉给予20g/L戊巴比妥钠（40mg/kg）深麻醉下，自胸骨处剪开胸腔，暴露心脏，自主动脉根部插入灌注针头并用生理盐水1000mL灌注，继之以10%福尔马林溶液500mL滴注行组织固定。待灌注固定完毕后，自背侧暴露脊髓，并将腰膨大（L5～L7）部位脊髓组织取出，浸泡于10%福尔马林溶液中过夜。24h后经乙醇脱水变干后，行石蜡包埋。沿冠状切面将脊髓组织切成6μm厚度切片，脱蜡膜后，常规苏木精一伊红（HE）染色。病理学改变由一不了解分组情况的观察者在200倍显微镜下观察。损伤及坏死神经元表现为胞核固缩或溶解，胸浆呈嗜伊红染色，胞浆中尼氏体消失，有的细胞固缩红染明显。正常神经元表现为多角形结构，胞核结构清晰，胞浆中尼氏体存在。病理损伤程度通过计数脊髓前角（沿中央导水管横线以前）正常神经元数来评估。
1.3 统计学分析
采用SPSS17.0统计学软件。所有生理学参数用（）表示，组间比较采用t检验。脊髓前角正常神经元计数采用完全随机设计的单因素方差分析（ANOVA）进行统计，后肢运动功能评分采用非参数秩和Kruskal-Wallis检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 生理学指标
脊髓缺血过程中血流动力学各项指标，直肠温度，PaO2，PaCO2，pH变化各组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。手术过程中，直肠温度保持在38.0～39.0℃。肾下腹主动脉阻闭前后股动脉压力在各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）表1。
2.2 后肢运动功能评分
术后动物无意外死亡。再灌注48h后，对照组动物后肢运动功能评分显著低于雌激素处理组（P=0.008），E3组显著高于E1组（P=0.026），E1、E2组比较差异无统计学意义，Sham组后肢功能无障碍为4分（图1）。
2.3 病理学观察
再灌注48h后，对照组脊髓前角光镜下可见正常神经元数量明显减少，神经细胞缺血变性坏死严重，胞浆深染，有的细胞核固缩，核仁消失，细胞周围有空泡形成；正常神经元数量显著少于雌激素处理组（P=0.006）（图2）。而E3组正常运动神经元较多，胞体呈多角形，核仁清晰，胞浆中尼氏体清晰（图3）。 3 讨论
本试验发现：在再灌注开始即刻，经兔耳缘静脉给予雌激素200，400，800μg/kg，可剂量依赖的增加脊髓前角运动神经元数目，显著改善缺血后下肢功能障碍，减轻兔脊髓缺血再灌注损伤。
我们通过病理发现Control组脊髓前角存在大量嗜伊红染色的坏死神经元；雌激素治疗组坏死神经元明显减少。而E1，E2组脊髓前角正常运动神经元与E3组相比，差异有统计学意义，神经功能评分也出现一致的结果。推测800μg/kg体内发挥较强的生物学作用，我们参考其他文献可知临时短暂应用此剂量雌激素未发现明显的副作用，可将其作为下步深入研究雌激素作用机制的剂量。
脊髓缺血再灌注损伤的主要机制是脊髓组织缺血后三磷酸腺苷（ATP）减少，细胞膜离子泵功能衰竭，钠离子内流造成细胞水肿，溶酶体破裂引起谷氨酸等兴奋性氨基酸释放增加，大量钙离子内流造成钙超载，激活多种酶类，生成大量自由基，引起严重炎症反应，最终导致细胞组织水肿破环血管痉挛阻塞，造成组织缺血再灌注损伤[13-17]。
以往的研究发现雌激素可减轻局部炎性反应，激活抗凋亡系统。新近研究提示雌激素的神经保护可能通过线粒体途径参与。线粒体是细胞氧化磷酸化中心，是细胞能量加工厂，其功能的衰竭是细胞死亡扳机点。以往的研究发现再灌注开始后，线粒体内产生大量氧自由基，破环细胞呼吸链，造成细胞能量衰竭而致死[10]。我们研究发现雌激素治疗组缺血脊髓匀浆后检测，超氧化物歧化酶（SOD）活性明显增加，SOD作为细胞内主要的自由基清除剂和抗氧化酶，其水平的降低，提示其保护组织细胞受毒性氧自由基损伤的效能减弱[10-20]。故推测雌激素减轻兔脊髓缺血再灌注损伤与其增加SOD水平，从而清除过量的氧自由基减轻损伤，发挥其保护作用。下一步研究将从细胞，在体两个层面深入研究雌激素的保护作用与线粒体损伤的关系。
总之，雌激素可剂量依赖的减轻兔脊髓缺血再灌注损伤，增加脊髓前角运动神经元数目，显著改善缺血后下肢功能障碍。
[参考文献]
[1] 阎平键，王峥，刘建光，等.依达拉奉对家兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用[J].神经损伤与功能重建，2012，7（3）：186-188.
[2] 方波，赵曦，王赫，等.缺血预处理对兔脊髓缺血再灌注损伤水通道蛋白-4表达的影响[J].中国组织化学与细胞化学杂志，2013，22（2）：121-125.
[3] 邓姣，丁倩，谷秋寒，等.长期重复高压氧预处理对兔脊髓缺血再灌注损伤的作用[C].2009国际麻醉学基础与临床研究论坛，2009：125.
[4] 宋文英，陈琼，熊利泽，等.缺血后处理上调内源性抗氧化物酶活性诱导兔脊髓保护效应[J].中华医学杂志，2008，88（33）：2355-2359.
[5]姚俊岩，翁浩，张兰，等.脊髓缺血再灌注损伤模型的改进及脊髓耐受缺血时限的研究[J].四川大学学报（医学版），2007，38（3）：497-500.
[6] Garcia-Segura LM，Azcoitia I，DonCarlos LL.Neuroprotection by estradiol[J].Prog Neurobiol，2001，63（1）：29-60.
[7] Darrell W.Brann，Krishnan Dhandapani，Chandramohan Wakade，et al.Neurotrophic and Neuroprotective actions of estrogen： basic mechanisms and clinical implications[J].Steroids，2007，72（5）：381-405.
[8] Meharvan Singh，James A.Dykens，James W.Simpkins.Novel mechanisms for estrogen-induced neuroprotection[J].Exp Biol Med，2006，231：514-521.
[9] Christoph Harms，Marion Lautenschlager，Alexandra Bergk，et al. Differential mechanisms of neuroprotection by 17-β estradiol in Apoptotic versus Necrotic Neurodegeneration[J]. The Journal of Neuroscience，2001，21（8）：2600-2609.
[10] 高鹏，熊利泽，路志红，等.缺血后处理对兔脊髓缺血-再灌注损伤中MDA和SOD的影响[J].第四军医大学学报，2006，27（14）：1273-1275.
[11] 陈琼，王强，熊利泽，等.七氟烷后处理对氧自由基介导减轻兔脊髓缺血再灌注损伤的作用[J].中华医学杂志，2008，88（27）：1916-1920.
[12] 邓姣，丁倩，熊利泽，等.不同高压氧预处理方案对兔脊髓缺血再灌注损伤的影响[J].中华麻醉学杂志，2009，29（11）：1036-1039.
[13] 杨小玉，朱庆三，赵立君，等.脊髓缺血-再灌注损伤细胞间粘附分子-1及白细胞介素-1β的表达[J].中国脊柱脊髓杂志，2004，14 （3）：167-170.
[14] 陈及非，阎作勤，龙作林，等.脊髓缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的实验研究[J].中国临床医学，2008，15（6）：772-774.
[15] 安国尧，张俐.NF-ΚB及VCAM-1在脊髓缺血再灌注损伤中的作用及机制[J].中国中医骨伤科杂志，2012，20（12）：73-75.
[16] 周青珍，阎平建，韩琦，等.法舒地尔对家兔脊髓缺血再灌注损伤的影响[J].卒中与神经疾病，2012，19（5）：270-272.
[17] 凡进，任永信，蔡卫华，等.兔脊髓缺血再灌注损伤时Bcl-xL/Bcl-2相关死亡启动因子的变化及其意义[J].中国脊柱脊髓杂志，2011，21（2）：142-147.
[18] 胡胜，熊利泽.远程缺血预处理研究进展[J].上海医学，2010，33（6）：598-601.
[19] 田丽颖，吕苗苗，张玉明，等.HIF-1α基因转染骨髓间充质干细胞治疗脊髓缺血-再灌注损伤早期超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量的变化[J].临床麻醉学杂志，2013，29（3）：279-281.
[20] 黄瀚，张兰，姚俊岩，等.缺血后处理和缺血预处理对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用[J].中华麻醉学杂志，2006，26（3）：281-282.
（收稿日期：2013-11-04）
[关键词] 雌激素；缺血再灌注；神经保护
[中图分类号] R318.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）23-35-04
脊髓手术或腹主动脉瘤等因术中阻断动脉，可能引起不同程度的脊髓缺血，或表现为神经功能一过性障碍，严重者则出现急性或迟发性截瘫。寻找有效的防治方法是目前研究的热点难点[1-5]。以前的研究证实了雌激素可减轻老年性痴呆、帕金森病和脑中风预后[6-9]，而有关其在脊髓缺血再灌注损伤的保护作用报道甚少。本实验目的旨在探讨雌激素在兔脊髓缺血再灌注损伤中的保护作用及其可能机制，并对其最佳使用剂量作一初步研究，为其在临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 一般资料
雄性新西兰大白兔40只，体质量2.0～2.5kg，购自上海生旺实验动物养殖场（合格证号：2007000700025），随机分为5组，每组8只。对照组（Control组）行单纯肾下腹主动脉阻闭20min，再灌注48h；假手术组（Sham组）行单纯手术操作不阻闭肾下腹主动脉；雌激素处理E1组（E1组）、雌激素处理E2组（E2组）、雌激素处理E3组（E3组），行肾下腹主动脉阻闭20min，再灌注开始即刻经耳缘静脉分别给予雌激素200，400，800μg/kg。
1.2 方法
所有动物实验前晚禁食，不限制饮水。实验前予20g/L戊巴比妥钠（40mg/kg）经兔耳缘静脉进行麻醉。术中使用复方乳酸钠4mL/（kg·h）静脉维持。行股动脉穿刺，接压力传感器监测股动脉压，并从压力波形读取脉率（PR）。自肛门放入温度探头持续监测肛温，术中维持肛温于38.0～39.0℃。选取缺血前、缺血10min以及再灌注10min抽取动脉血样测定PaO2，PaCO2，pH等。
1.2.1 脊髓缺血模型制作 参照文献及本实验室以往所采用的方法[10-12]，取腹正中切口，自剑突下两指剪开皮肤、腹膜，暴露左侧肾脏及腹主动脉，选取左肾动脉分支下0.8cm处阻闭腹主动脉，阻闭20min后恢复再灌注。动脉阻闭以股动脉压力波形消失，远端动脉压力监测值MAP≤10mm Hg为阻闭成功。开放时则以股动脉压力波形恢复为准。
1.2.2 后肢运动功能评分 手术结束后将动物放回笼中进行单独饲养观察，自由饮食。再灌注后48h，由一名不了解分组情况的观察者进行后肢运动功能评分，评分方法采用修正Tarlov标准：4分，后肢功能完全恢复，能正常行走；3分，可站立但无法行走；2分，后肢可自由活动但无法站立；1分，有可觉察的关节自主活动；0分，没有可觉察的下肢活动。
1.2.3 病理学观察 所有动物在再灌注48h神经功能评分结束后，静脉给予20g/L戊巴比妥钠（40mg/kg）深麻醉下，自胸骨处剪开胸腔，暴露心脏，自主动脉根部插入灌注针头并用生理盐水1000mL灌注，继之以10%福尔马林溶液500mL滴注行组织固定。待灌注固定完毕后，自背侧暴露脊髓，并将腰膨大（L5～L7）部位脊髓组织取出，浸泡于10%福尔马林溶液中过夜。24h后经乙醇脱水变干后，行石蜡包埋。沿冠状切面将脊髓组织切成6μm厚度切片，脱蜡膜后，常规苏木精一伊红（HE）染色。病理学改变由一不了解分组情况的观察者在200倍显微镜下观察。损伤及坏死神经元表现为胞核固缩或溶解，胸浆呈嗜伊红染色，胞浆中尼氏体消失，有的细胞固缩红染明显。正常神经元表现为多角形结构，胞核结构清晰，胞浆中尼氏体存在。病理损伤程度通过计数脊髓前角（沿中央导水管横线以前）正常神经元数来评估。
1.3 统计学分析
采用SPSS17.0统计学软件。所有生理学参数用（）表示，组间比较采用t检验。脊髓前角正常神经元计数采用完全随机设计的单因素方差分析（ANOVA）进行统计，后肢运动功能评分采用非参数秩和Kruskal-Wallis检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 生理学指标
脊髓缺血过程中血流动力学各项指标，直肠温度，PaO2，PaCO2，pH变化各组间比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。手术过程中，直肠温度保持在38.0～39.0℃。肾下腹主动脉阻闭前后股动脉压力在各组间比较，差异无统计学意义（P>0.05）表1。
2.2 后肢运动功能评分
术后动物无意外死亡。再灌注48h后，对照组动物后肢运动功能评分显著低于雌激素处理组（P=0.008），E3组显著高于E1组（P=0.026），E1、E2组比较差异无统计学意义，Sham组后肢功能无障碍为4分（图1）。
2.3 病理学观察
再灌注48h后，对照组脊髓前角光镜下可见正常神经元数量明显减少，神经细胞缺血变性坏死严重，胞浆深染，有的细胞核固缩，核仁消失，细胞周围有空泡形成；正常神经元数量显著少于雌激素处理组（P=0.006）（图2）。而E3组正常运动神经元较多，胞体呈多角形，核仁清晰，胞浆中尼氏体清晰（图3）。 3 讨论
本试验发现：在再灌注开始即刻，经兔耳缘静脉给予雌激素200，400，800μg/kg，可剂量依赖的增加脊髓前角运动神经元数目，显著改善缺血后下肢功能障碍，减轻兔脊髓缺血再灌注损伤。
我们通过病理发现Control组脊髓前角存在大量嗜伊红染色的坏死神经元；雌激素治疗组坏死神经元明显减少。而E1，E2组脊髓前角正常运动神经元与E3组相比，差异有统计学意义，神经功能评分也出现一致的结果。推测800μg/kg体内发挥较强的生物学作用，我们参考其他文献可知临时短暂应用此剂量雌激素未发现明显的副作用，可将其作为下步深入研究雌激素作用机制的剂量。
脊髓缺血再灌注损伤的主要机制是脊髓组织缺血后三磷酸腺苷（ATP）减少，细胞膜离子泵功能衰竭，钠离子内流造成细胞水肿，溶酶体破裂引起谷氨酸等兴奋性氨基酸释放增加，大量钙离子内流造成钙超载，激活多种酶类，生成大量自由基，引起严重炎症反应，最终导致细胞组织水肿破环血管痉挛阻塞，造成组织缺血再灌注损伤[13-17]。
以往的研究发现雌激素可减轻局部炎性反应，激活抗凋亡系统。新近研究提示雌激素的神经保护可能通过线粒体途径参与。线粒体是细胞氧化磷酸化中心，是细胞能量加工厂，其功能的衰竭是细胞死亡扳机点。以往的研究发现再灌注开始后，线粒体内产生大量氧自由基，破环细胞呼吸链，造成细胞能量衰竭而致死[10]。我们研究发现雌激素治疗组缺血脊髓匀浆后检测，超氧化物歧化酶（SOD）活性明显增加，SOD作为细胞内主要的自由基清除剂和抗氧化酶，其水平的降低，提示其保护组织细胞受毒性氧自由基损伤的效能减弱[10-20]。故推测雌激素减轻兔脊髓缺血再灌注损伤与其增加SOD水平，从而清除过量的氧自由基减轻损伤，发挥其保护作用。下一步研究将从细胞，在体两个层面深入研究雌激素的保护作用与线粒体损伤的关系。
总之，雌激素可剂量依赖的减轻兔脊髓缺血再灌注损伤，增加脊髓前角运动神经元数目，显著改善缺血后下肢功能障碍。
[参考文献]
[1] 阎平键，王峥，刘建光，等.依达拉奉对家兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用[J].神经损伤与功能重建，2012，7（3）：186-188.
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[16] 周青珍，阎平建，韩琦，等.法舒地尔对家兔脊髓缺血再灌注损伤的影响[J].卒中与神经疾病，2012，19（5）：270-272.
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[20] 黄瀚，张兰，姚俊岩，等.缺血后处理和缺血预处理对兔脊髓缺血再灌注损伤的保护作用[J].中华麻醉学杂志，2006，26（3）：281-282.
（收稿日期：2013-11-04）