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摘要：目的 研究大鼠皮肤类过敏试验方法的适用性和可靠性，对中药注射剂潜在的类过敏反应进行检测和评价。方法 以C48/80为工具药物，对可能影响大鼠皮肤类过敏试验的灵敏度和可靠性因素进行比较研究，优选最佳试验条件，选用Tween80、内毒素、中华眼镜蛇毒素、天花粉蛋白注射液、痰热清注射液和血塞通注射液进行考察和应用。结果 大鼠皮肤类过敏反应试验方法最佳条件为：采用胰岛素注射器（口径0.33 mm）进行药物注射，50～100 μL/点，给药后立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝染液1 mL，15 min时颈动脉放血处死大鼠，剪取背部皮肤处理。采用该方法，Tween80、内毒素、中华眼镜蛇毒素、天花粉蛋白注射液均呈现一定的诱导大鼠皮肤出现蓝斑的能力，痰热清注射液给予临床剂量无蓝斑出现。血塞通注射液临床剂量虽可引起大鼠皮肤蓝斑，但不排除与因其本身的药效作用干扰所致。结论 该方法操作简便，试验周期短，需用药量少，检测敏感性高，结果重复性好，但易受药物本身特性干扰而出现假阳性。
关键词：大鼠皮肤试验；类过敏；方法学研究；C48/80；内毒素；血塞通注射液；痰热清注射液
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0067-05
类过敏反应发生时，机体出现皮肤瘙痒、颜面潮红、皮疹、全身低血压、水肿、呼吸急促等症状，其中皮肤红斑、皮疹等损害是最常见的症状[1]，症状较轻时即会出现，皮肤症状反应对类过敏反应的发生及程度具有一定代表性。本研究围绕类过敏发生时大鼠皮肤反应特点设计试验，以C48/80为工具药物，对药物最佳作用时间进行探索，对可能影响试验灵敏度和可靠性的因素，包括动物性别、药物剂量、染液浓度、皮内注射容积、注射器类型及注射针头口径等进行比较研究，优选最佳试验条件。在此基础上，选用Tween80、内毒素、中华眼镜蛇毒素、天花粉蛋白注射液、痰热清注射液和血塞通注射液，对试验方法的适用性和可靠性进行考察，对中药注射剂潜在的类过敏反应进行检测和评价。
1 实验材料
1.1 动物
SD大鼠，清洁级，雌雄兼用，180～220 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（沪）2008-0016，饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级饲养室，实验期间自由饮水、摄食，室内温度20～22 ℃。
1.2 药物
C48/80，Sigma公司产品，批号039K4023，加生理盐水（NS）配制成15 μg/mL浓度。Tween80（V/V），Sigma公司产品，批号BCBF4913V，加生理盐水配制成0.5%、2.0%、8.0% 3种浓度。内毒素，Sigma公司产品，批号L2880，加生理盐水配制成25、50、100 μg/mL。中华眼镜蛇毒素，上海普振生物科技有限公司提供，批号N3MCC9LE，加生理盐水配制成1、5、25 μg/mL 3种浓度。天花粉蛋白注射液，上海金山制药厂产品，批号111101，加生理盐水配制成0.05、0.25、1.20 mg/mL （原液）3种浓度。血塞通注射液，昆明制药厂产品，批号Z53020664，50 mg/mL（原液）。试验时用1 mL无菌注射器吸取原液加生理盐水配制成6.25、12.5、25 mg/mL（临床高浓度的4、8、16倍浓度）药液备用。痰热清注射液，上海凯宝药业股份有限公司产品，批号1210221，10 mL/支。试验时加生理盐水配制成0.04（临床滴注低浓度）、0.1 mL/mL（临床滴注高浓度）药液备用。
1.3 主要试剂与仪器
分析纯丙酮（国药集团化学试剂有限公司，批号20120504）；伊文思蓝（国药集团化学试剂有限公司，批号W20111101），组胺ELISA试剂盒（Demeditec产品，批号11411）。紫外分光光度计（AGILENT 8345）， 2-16K离心机（Sigma公司）。
2 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料采用—x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐性时采用LSD检验，方差不齐时用Dunnett’s方法检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
3 试验方法与结果
3.1 试验方法初步建立
SD大鼠6只，称重后，25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，用电动剃毛刀在其背部剃毛3 cm×4 cm，在其脊柱两侧皮内注射120 μg/mL C48/80 4个点，0.1 mL/点，立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝染液，1 mL/只，分别于5、10、20、30 min剪取背部皮肤，拍照并测量蓝斑直径，将蓝色斑块剪碎于3 mL丙酮-生理盐水（7∶3）混合液中，4 ℃浸泡过夜，5000 r/min离心10 min， 610 nm波长（分光光度计测定）处测定其吸收度，并计算敏感系数。敏感系数=C48/80组均值/NS组均值。结果C48/80作用时间为10～20 min时，蓝斑直径和渗出染液OD值最大，敏感系数稳定且较高。提示C48/80最佳作用时间为皮下注射后10～20 min。因此，后续试验以15 min作为C48/80致大鼠皮肤类过敏反应的优选作用时间。见表1、表2。
3.2 影响因素考察和优化
3.2.1 动物性别及工具药物剂量 SD大鼠12只，雌雄各半，称重后用25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，背部剃毛3 cm×4 cm，在脊柱两侧分别注射NS及1、4、15、60 μg/mL C48/80溶液，100 μL/点，立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝溶液，1 mL/只，15 min后颈动脉放血处死大鼠，剪取背部皮肤，拍照并测量蓝斑直径。随后将皮肤蓝斑剪碎于3 mL丙酮-生理盐水（7∶3）混合液中过夜，5000 r/min离心10 min后于610 nm测定OD值。结果，综合蓝斑直径与蓝斑OD值这2项检测指标，雌性大鼠比雄性大鼠更加敏感，C48/80以15～60 μg/mL剂量为优选，综合考虑认为以15 μg/mL剂量比较适中。因此后续试验选用雌性为受试动物，设置15 μg/mL作为C48/80工具药物优选剂量。见表3。 3.2.2 伊文思蓝浓度与皮内注射容积 雌性SD大鼠12只，随机分为2组（0.5%、1.0%伊文思蓝组），称重后用25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，背部剃毛3 cm×4 cm，在脊柱一侧用胰岛素注射器注射NS 25、50、100 μL共3个点，另一侧注射15 μg/mL C48/80 25、50、100 μL共3个点，立即尾静脉注射0.5%或1.0%伊文思蓝溶液，1 mL/只，后续处理同“3.2.1”项下方法。结果，从蓝斑浸出液OD值与蓝斑直径这2个指标看，25 μL注射容积下模型最为敏感，但因25 μL注射容积较小，操作上易造成误差（针头内相对残留量增大）而降低剂量精确度，而100 μL注射容积下NS对照组蓝斑直径较大（>0.5 cm），故以50 μL作为优选药物注射容积。对应50 μL容积，0.5%伊文思蓝组蓝斑直径与蓝斑OD值敏感系数均高于1.0%伊文思蓝组。故后续试验采用50 μL作为药物注射容积、0.5%伊文思蓝溶液作为尾静脉注射染液浓度。见表4、表5。
3.2.3 注射器类型及注射针头口径 雌性SD大鼠6只，称重后，25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，背部剃毛3 cm×4 cm，在脊柱一侧用胰岛素注射器（口径：0.33 mm）注射NS及15、30 μg/mL C48/80溶液共3个点，另一侧用普通1 mL无菌塑料注射器（口径：0.45 mm）进行同样注射，立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝溶液，1 mL/只，后续处理同“3.2.1”项下方法。结果，采用胰岛素注射器注射给药能减小NS组蓝斑直径及蓝斑浸出液OD值，且胰岛素注射器各C48/80组蓝斑直径及蓝斑浸出液OD值相对于NS组变化均大于对应普通1 mL注射器组，因此，后续试验以胰岛素注射器（针头口径0.33 mm）作为大鼠皮肤类过敏试验皮内注射的优选注射器。见表6、表7。
3.3 方法适用性考察
SD大鼠30只，随机分为5组，每组6只，称质量后，25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，背部剃毛3 cm×4 cm，在其脊柱两侧皮内注射不同浓度的Tween80、中华眼镜蛇毒素、天花粉蛋白注射液、内毒素类过敏阳性药物，阴性对照注射等体积NS，以C48/80作为阳性对照药物，50 μL/点，立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝染液1 mL，后续处理同“3.2.1”项下方法。结果显示，2%、8%Tween80能使大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值明显增大，其中2%、8% Tween80蓝斑直径>0.5 cm， 8% Tween80蓝斑直径与NS组比较差异有统计学意义，8% Tween80蓝斑浸出液OD值因方差过大而差异无统计学意义。0.5% Tween80对大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑OD值均无明显影响。见表8。
100 μg/mL内毒素能使大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值明显增大，其中蓝斑直径>0.5 cm，但与NS组比较差异无统计学意义，蓝斑浸出液OD值与NS组比较差异有统计学意义；25、50 μg/mL内毒素对大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值均无明显影响。见表9。
1、5、25 μg/mL中华眼镜蛇毒素均能使大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值明显增大，除1 μg/mL蓝斑直径比较差异无统计学意义，其余各剂量大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值与相应NS组比较差异有统计学意义。见表10。
0.05、0.25、1.2 mg/mL天花粉蛋白注射液均能使大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值明显增大，除0.25、1.2 mg/mL蓝斑OD值差异无统计学意义外，其余各剂量大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值与相应NS组比较差异有统计学意义。见表11。
3.4 中药注射剂类过敏反应检测
SD大鼠12只，称重后，25%乌拉坦麻醉（4 mL/kg），背部剃毛3 cm×4 cm，在其脊柱两侧皮内分别注射血塞通注射液6.25、12.5、25 mg/mL 3个浓度和痰热清注射液0.04、0.1 mg/mL 2个浓度，50 μL/点，立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝染液1 mL，15 min时颈动脉放血处死大鼠，剪取背部皮肤，拍照并测量蓝斑直径，蓝斑剪碎于3 mL丙酮-生理盐水（7∶3）混合液浸泡过夜，5000 r/min离心10 min，分光光度计610 nm测定上清液OD值。
结果，血塞通注射液各剂量组蓝斑直径均>0.5 cm，蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值均明显升高，与NS组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。见表12。痰热清注射液各剂量组蓝斑直径均<0.5 cm，蓝斑直径和蓝斑OD值均无明显变化。见表13。
4 讨论
类过敏药物在体内的靶效应细胞有2种：一种为以RBL-2H3细胞为代表的血液嗜碱性粒细胞；一种为存在于黏膜及结缔组织中的肥大细胞（MC）。其中胃肠道黏膜及皮肤结缔组织MC含量丰富，过敏或类过敏反应发生时可出现明显的胃肠道充血、胃酸分泌及皮肤红斑。本研究以类过敏反应发生时皮肤病理生理改变为基础，探索和优化大鼠皮肤类过敏反应评价方法，弥补RBL-2H3细胞不能完全代表MC特性的不足[2]，通过类过敏发生时较为直观的整体动物皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值指标对其进行检测和评价。
试验结果显示：工具药物C48/80（1 μg/mL）在极低剂量下即可使大鼠皮肤出现明显蓝斑，蓝斑大小与给药剂量和作用时间明显相关。C48/80致大鼠皮肤通透性增高症状于注射药物后即刻出现，以注射后10～20 min时蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值绝对值最大，敏感系数较高且较为稳定。伊文思蓝浓度以0.5%最为敏感，在注射伊文思蓝后检测时间应控制在10～20 min之间，以15 min为好。对皮内药物注射容积进行研究后显示以50～100 μL为宜，50 μL最佳，因25 μL体积过小而影响注射精确度。大鼠皮肤类过敏反应雌雄变化趋势相同，但雌性更为敏感，与临床类过敏反应女性发生率（66%）高于男性（34%）[3]报道一致。在试验中发现，注射器在进行药物注射时可能会破坏被注射皮肤处血管，造成染液外渗而出现蓝斑，这种破坏约5～10 min可自行修复。因此以针头口径为0.33 mm胰岛素注射器作为大鼠皮肤类过敏试验皮内注射的优选注射器，且后者因针头与管腔一体，也比普通1 mL注射器使用方便，不易漏液。 采用本试验方法，Tween80、内毒素、中华眼镜蛇毒素、天花粉蛋白注射液均呈现出一定的诱导类过敏反应的能力。痰热清注射液临床用量为20 mL/次，加入0.9%氯化钠注射液250～500 mL中供静脉滴注，即临床浓度为0.04～0.08 mg/mL。本试验选用2组临床给药浓度（0.04、0.08 mg/mL）、2组2～8倍临床给药浓度（0.16、0.32 mg/mL），结果显示，给予2～4倍临床给药浓度，大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值均呈阴性反应，4～8倍临床给药浓度则两指标均呈阳性反应。
血塞通注射液临床用量为200～400 mg/次，加入0.9%氯化钠注射液250～500 mL中供静脉滴注，即临床浓度为0.4～1.6 mg/mL。本试验选用3组临床给药浓度（0.4、0.8、1.6 mg/mL）、1组2～8倍临床给药浓度（3.2 mg/mL），结果大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值均呈阳性反应。进一步分析后认为，血塞通注射液由于本身具有扩张血管、抑制血小板聚集、延长凝血时间等作用[4]，所以不排除当其注入皮肤后，可能会促使皮肤局部血管扩张，针头注入所致破损血管凝血修复时间延长，注入的伊文思蓝染料渗出血管进入组织的机会增加，从而导致蓝斑直径变大和蓝斑浸出液OD值升高，由此造成假阳性反应。我们认为对此类情况，有必要借助整体试验，即通过检测给药后动物行为变化及血液类过敏反应等指标，综合判定该制剂的类过敏性质。
综上，本方法用于检测药物类过敏具有灵敏、简便、快速、经济的特点，其缺点是不能对药物的具体致类过敏机制进行研究，对于具有活血化瘀功能或有强烈刺激性的受试药物可能因药效作用而出现检测的假阳性，应注意区别。
参考文献：
[1] 吴嘉瑞，张冰，董玲，等.中药注射剂不良反应信息的系统分析与评价[J].中国医药指南，2012，10（20）：274-276.
[2] Passante E， Ehrhardt C， Sheridan H， et al. RBL-2H3 cells are an imprecise model for mast cell mediator release[J]. Inflamm Res， 2009，58（9）：611-618.
[3] 田玉科.围手术期过敏反应及类过敏样反应[J].医学新知杂志， 2005，15（2）：7-9.
[4] 陆妙，黎涛.我院16例血塞通注射液致不良反应回顾性分析[J].中国药房，2007，18（14）：1103-1104.
（收稿日期：2013-07-27，编辑：华强）
关键词：大鼠皮肤试验；类过敏；方法学研究；C48/80；内毒素；血塞通注射液；痰热清注射液
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0067-05
类过敏反应发生时，机体出现皮肤瘙痒、颜面潮红、皮疹、全身低血压、水肿、呼吸急促等症状，其中皮肤红斑、皮疹等损害是最常见的症状[1]，症状较轻时即会出现，皮肤症状反应对类过敏反应的发生及程度具有一定代表性。本研究围绕类过敏发生时大鼠皮肤反应特点设计试验，以C48/80为工具药物，对药物最佳作用时间进行探索，对可能影响试验灵敏度和可靠性的因素，包括动物性别、药物剂量、染液浓度、皮内注射容积、注射器类型及注射针头口径等进行比较研究，优选最佳试验条件。在此基础上，选用Tween80、内毒素、中华眼镜蛇毒素、天花粉蛋白注射液、痰热清注射液和血塞通注射液，对试验方法的适用性和可靠性进行考察，对中药注射剂潜在的类过敏反应进行检测和评价。
1 实验材料
1.1 动物
SD大鼠，清洁级，雌雄兼用，180～220 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（沪）2008-0016，饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级饲养室，实验期间自由饮水、摄食，室内温度20～22 ℃。
1.2 药物
C48/80，Sigma公司产品，批号039K4023，加生理盐水（NS）配制成15 μg/mL浓度。Tween80（V/V），Sigma公司产品，批号BCBF4913V，加生理盐水配制成0.5%、2.0%、8.0% 3种浓度。内毒素，Sigma公司产品，批号L2880，加生理盐水配制成25、50、100 μg/mL。中华眼镜蛇毒素，上海普振生物科技有限公司提供，批号N3MCC9LE，加生理盐水配制成1、5、25 μg/mL 3种浓度。天花粉蛋白注射液，上海金山制药厂产品，批号111101，加生理盐水配制成0.05、0.25、1.20 mg/mL （原液）3种浓度。血塞通注射液，昆明制药厂产品，批号Z53020664，50 mg/mL（原液）。试验时用1 mL无菌注射器吸取原液加生理盐水配制成6.25、12.5、25 mg/mL（临床高浓度的4、8、16倍浓度）药液备用。痰热清注射液，上海凯宝药业股份有限公司产品，批号1210221，10 mL/支。试验时加生理盐水配制成0.04（临床滴注低浓度）、0.1 mL/mL（临床滴注高浓度）药液备用。
1.3 主要试剂与仪器
分析纯丙酮（国药集团化学试剂有限公司，批号20120504）；伊文思蓝（国药集团化学试剂有限公司，批号W20111101），组胺ELISA试剂盒（Demeditec产品，批号11411）。紫外分光光度计（AGILENT 8345）， 2-16K离心机（Sigma公司）。
2 统计学方法
采用SPSS19.0统计软件进行分析。计量资料采用—x±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较方差齐性时采用LSD检验，方差不齐时用Dunnett’s方法检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
3 试验方法与结果
3.1 试验方法初步建立
SD大鼠6只，称重后，25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，用电动剃毛刀在其背部剃毛3 cm×4 cm，在其脊柱两侧皮内注射120 μg/mL C48/80 4个点，0.1 mL/点，立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝染液，1 mL/只，分别于5、10、20、30 min剪取背部皮肤，拍照并测量蓝斑直径，将蓝色斑块剪碎于3 mL丙酮-生理盐水（7∶3）混合液中，4 ℃浸泡过夜，5000 r/min离心10 min， 610 nm波长（分光光度计测定）处测定其吸收度，并计算敏感系数。敏感系数=C48/80组均值/NS组均值。结果C48/80作用时间为10～20 min时，蓝斑直径和渗出染液OD值最大，敏感系数稳定且较高。提示C48/80最佳作用时间为皮下注射后10～20 min。因此，后续试验以15 min作为C48/80致大鼠皮肤类过敏反应的优选作用时间。见表1、表2。
3.2 影响因素考察和优化
3.2.1 动物性别及工具药物剂量 SD大鼠12只，雌雄各半，称重后用25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，背部剃毛3 cm×4 cm，在脊柱两侧分别注射NS及1、4、15、60 μg/mL C48/80溶液，100 μL/点，立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝溶液，1 mL/只，15 min后颈动脉放血处死大鼠，剪取背部皮肤，拍照并测量蓝斑直径。随后将皮肤蓝斑剪碎于3 mL丙酮-生理盐水（7∶3）混合液中过夜，5000 r/min离心10 min后于610 nm测定OD值。结果，综合蓝斑直径与蓝斑OD值这2项检测指标，雌性大鼠比雄性大鼠更加敏感，C48/80以15～60 μg/mL剂量为优选，综合考虑认为以15 μg/mL剂量比较适中。因此后续试验选用雌性为受试动物，设置15 μg/mL作为C48/80工具药物优选剂量。见表3。 3.2.2 伊文思蓝浓度与皮内注射容积 雌性SD大鼠12只，随机分为2组（0.5%、1.0%伊文思蓝组），称重后用25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，背部剃毛3 cm×4 cm，在脊柱一侧用胰岛素注射器注射NS 25、50、100 μL共3个点，另一侧注射15 μg/mL C48/80 25、50、100 μL共3个点，立即尾静脉注射0.5%或1.0%伊文思蓝溶液，1 mL/只，后续处理同“3.2.1”项下方法。结果，从蓝斑浸出液OD值与蓝斑直径这2个指标看，25 μL注射容积下模型最为敏感，但因25 μL注射容积较小，操作上易造成误差（针头内相对残留量增大）而降低剂量精确度，而100 μL注射容积下NS对照组蓝斑直径较大（>0.5 cm），故以50 μL作为优选药物注射容积。对应50 μL容积，0.5%伊文思蓝组蓝斑直径与蓝斑OD值敏感系数均高于1.0%伊文思蓝组。故后续试验采用50 μL作为药物注射容积、0.5%伊文思蓝溶液作为尾静脉注射染液浓度。见表4、表5。
3.2.3 注射器类型及注射针头口径 雌性SD大鼠6只，称重后，25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，背部剃毛3 cm×4 cm，在脊柱一侧用胰岛素注射器（口径：0.33 mm）注射NS及15、30 μg/mL C48/80溶液共3个点，另一侧用普通1 mL无菌塑料注射器（口径：0.45 mm）进行同样注射，立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝溶液，1 mL/只，后续处理同“3.2.1”项下方法。结果，采用胰岛素注射器注射给药能减小NS组蓝斑直径及蓝斑浸出液OD值，且胰岛素注射器各C48/80组蓝斑直径及蓝斑浸出液OD值相对于NS组变化均大于对应普通1 mL注射器组，因此，后续试验以胰岛素注射器（针头口径0.33 mm）作为大鼠皮肤类过敏试验皮内注射的优选注射器。见表6、表7。
3.3 方法适用性考察
SD大鼠30只，随机分为5组，每组6只，称质量后，25%乌拉坦（4 mL/kg）麻醉，背部剃毛3 cm×4 cm，在其脊柱两侧皮内注射不同浓度的Tween80、中华眼镜蛇毒素、天花粉蛋白注射液、内毒素类过敏阳性药物，阴性对照注射等体积NS，以C48/80作为阳性对照药物，50 μL/点，立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝染液1 mL，后续处理同“3.2.1”项下方法。结果显示，2%、8%Tween80能使大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值明显增大，其中2%、8% Tween80蓝斑直径>0.5 cm， 8% Tween80蓝斑直径与NS组比较差异有统计学意义，8% Tween80蓝斑浸出液OD值因方差过大而差异无统计学意义。0.5% Tween80对大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑OD值均无明显影响。见表8。
100 μg/mL内毒素能使大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值明显增大，其中蓝斑直径>0.5 cm，但与NS组比较差异无统计学意义，蓝斑浸出液OD值与NS组比较差异有统计学意义；25、50 μg/mL内毒素对大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值均无明显影响。见表9。
1、5、25 μg/mL中华眼镜蛇毒素均能使大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值明显增大，除1 μg/mL蓝斑直径比较差异无统计学意义，其余各剂量大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值与相应NS组比较差异有统计学意义。见表10。
0.05、0.25、1.2 mg/mL天花粉蛋白注射液均能使大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值明显增大，除0.25、1.2 mg/mL蓝斑OD值差异无统计学意义外，其余各剂量大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值与相应NS组比较差异有统计学意义。见表11。
3.4 中药注射剂类过敏反应检测
SD大鼠12只，称重后，25%乌拉坦麻醉（4 mL/kg），背部剃毛3 cm×4 cm，在其脊柱两侧皮内分别注射血塞通注射液6.25、12.5、25 mg/mL 3个浓度和痰热清注射液0.04、0.1 mg/mL 2个浓度，50 μL/点，立即尾静脉注射0.5%伊文思蓝染液1 mL，15 min时颈动脉放血处死大鼠，剪取背部皮肤，拍照并测量蓝斑直径，蓝斑剪碎于3 mL丙酮-生理盐水（7∶3）混合液浸泡过夜，5000 r/min离心10 min，分光光度计610 nm测定上清液OD值。
结果，血塞通注射液各剂量组蓝斑直径均>0.5 cm，蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值均明显升高，与NS组比较差异均有统计学意义（P<0.01）。见表12。痰热清注射液各剂量组蓝斑直径均<0.5 cm，蓝斑直径和蓝斑OD值均无明显变化。见表13。
4 讨论
类过敏药物在体内的靶效应细胞有2种：一种为以RBL-2H3细胞为代表的血液嗜碱性粒细胞；一种为存在于黏膜及结缔组织中的肥大细胞（MC）。其中胃肠道黏膜及皮肤结缔组织MC含量丰富，过敏或类过敏反应发生时可出现明显的胃肠道充血、胃酸分泌及皮肤红斑。本研究以类过敏反应发生时皮肤病理生理改变为基础，探索和优化大鼠皮肤类过敏反应评价方法，弥补RBL-2H3细胞不能完全代表MC特性的不足[2]，通过类过敏发生时较为直观的整体动物皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值指标对其进行检测和评价。
试验结果显示：工具药物C48/80（1 μg/mL）在极低剂量下即可使大鼠皮肤出现明显蓝斑，蓝斑大小与给药剂量和作用时间明显相关。C48/80致大鼠皮肤通透性增高症状于注射药物后即刻出现，以注射后10～20 min时蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值绝对值最大，敏感系数较高且较为稳定。伊文思蓝浓度以0.5%最为敏感，在注射伊文思蓝后检测时间应控制在10～20 min之间，以15 min为好。对皮内药物注射容积进行研究后显示以50～100 μL为宜，50 μL最佳，因25 μL体积过小而影响注射精确度。大鼠皮肤类过敏反应雌雄变化趋势相同，但雌性更为敏感，与临床类过敏反应女性发生率（66%）高于男性（34%）[3]报道一致。在试验中发现，注射器在进行药物注射时可能会破坏被注射皮肤处血管，造成染液外渗而出现蓝斑，这种破坏约5～10 min可自行修复。因此以针头口径为0.33 mm胰岛素注射器作为大鼠皮肤类过敏试验皮内注射的优选注射器，且后者因针头与管腔一体，也比普通1 mL注射器使用方便，不易漏液。 采用本试验方法，Tween80、内毒素、中华眼镜蛇毒素、天花粉蛋白注射液均呈现出一定的诱导类过敏反应的能力。痰热清注射液临床用量为20 mL/次，加入0.9%氯化钠注射液250～500 mL中供静脉滴注，即临床浓度为0.04～0.08 mg/mL。本试验选用2组临床给药浓度（0.04、0.08 mg/mL）、2组2～8倍临床给药浓度（0.16、0.32 mg/mL），结果显示，给予2～4倍临床给药浓度，大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值均呈阴性反应，4～8倍临床给药浓度则两指标均呈阳性反应。
血塞通注射液临床用量为200～400 mg/次，加入0.9%氯化钠注射液250～500 mL中供静脉滴注，即临床浓度为0.4～1.6 mg/mL。本试验选用3组临床给药浓度（0.4、0.8、1.6 mg/mL）、1组2～8倍临床给药浓度（3.2 mg/mL），结果大鼠皮肤蓝斑直径和蓝斑浸出液OD值均呈阳性反应。进一步分析后认为，血塞通注射液由于本身具有扩张血管、抑制血小板聚集、延长凝血时间等作用[4]，所以不排除当其注入皮肤后，可能会促使皮肤局部血管扩张，针头注入所致破损血管凝血修复时间延长，注入的伊文思蓝染料渗出血管进入组织的机会增加，从而导致蓝斑直径变大和蓝斑浸出液OD值升高，由此造成假阳性反应。我们认为对此类情况，有必要借助整体试验，即通过检测给药后动物行为变化及血液类过敏反应等指标，综合判定该制剂的类过敏性质。
综上，本方法用于检测药物类过敏具有灵敏、简便、快速、经济的特点，其缺点是不能对药物的具体致类过敏机制进行研究，对于具有活血化瘀功能或有强烈刺激性的受试药物可能因药效作用而出现检测的假阳性，应注意区别。
参考文献：
[1] 吴嘉瑞，张冰，董玲，等.中药注射剂不良反应信息的系统分析与评价[J].中国医药指南，2012，10（20）：274-276.
[2] Passante E， Ehrhardt C， Sheridan H， et al. RBL-2H3 cells are an imprecise model for mast cell mediator release[J]. Inflamm Res， 2009，58（9）：611-618.
[3] 田玉科.围手术期过敏反应及类过敏样反应[J].医学新知杂志， 2005，15（2）：7-9.
[4] 陆妙，黎涛.我院16例血塞通注射液致不良反应回顾性分析[J].中国药房，2007，18（14）：1103-1104.
（收稿日期：2013-07-27，编辑：华强）