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摘要：为探明番茄在温度逆境下抗坏血酸(AsA)代谢系统抗氧化的生理机制，以番茄幼苗为试材，分别研究了高温(40℃)和低温(5℃)胁迫(0、4、8、12、24、36 h)下，叶片AsA代谢的主要酶L－半乳糖－1，4－内酯脱氢酶(GalLDH)、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、抗坏血酸过氧化物酶(APx)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)和谷胱甘肽还原酶(GR)活性与AsA、脱氢抗坏血酸(DHA)和AsA+DHA含量的变化。结果表明：在高温和低温胁迫下，除36 h外，番茄叶片AsA、DHA和A8A+DHA含量和GalLDH、DHAR、APX、MDHAR及GR活性均明显高于25℃(CK)处理，H2O2含量始终明显高于CK，AsA/DHA始终明显低于CK，说明短时间(24 h)高温和低温胁迫，番茄幼苗以AsA为核心的抗氧化系统功能明显增强，但长时间(36 h)温度胁迫，AsA抗氧化系统的功能明显下降，导致H2O2的积累。
关键词：番茄；高温；低温；抗坏血酸；抗坏血酸系统
中图分类号：S641.201 文献标识号：A 文章编号：1001-4942(2010)04-0022-05
番茄属喜温不耐热的蔬菜，夏秋露地以及日光温室和大棚栽培，常遇35℃以上高温，往往导致其生育异常；番茄对低温也较敏感，8℃时生长发育严重受阻，5℃时生长完全停止。因此，温度逆境成为影响番茄产量和品质的主要因素之一。
高温和低温均会导致植物活性氧自由基积累，进而形成氧化胁迫。通过调节自身的抗氧化系统，植物可清除活性氧自由基而免受或减少伤害。以抗坏血酸(AsA)为核心的抗氧化系统在植物清除活性氧过程中具有重要的作用。植物AsA代谢途径已较为明确，AsA主要是通过半乳糖途径合成，L一半乳糖－1，4-内酯脱氢酶(GalLDH)为催化该途径最后一步反应的关键酶。AsA在抗坏血酸过氧化物酶(APX)作用下氧化生成单脱氢抗坏血酸(MDHA)。MDHA经非酶歧化反应形成脱氢抗坏血酸(DHA)。两者分别通过单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)的作用被还原再生。因此，GalLDH、APX、MDHAR、DHAR和GR为影响AsA代谢的重要酶，并被证明参与植物对活性氧的清除作用。
目前，有关番茄在温度逆境下AsA代谢系统的变化尚未见报道。本试验以番茄幼苗为试材，旨在探明其在温度逆境下AsA代谢系统抗氧化的生理机制，以期为番茄在栽培中抵御温度胁迫提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 供试材料
试材番茄品种为“S以12粉”，由青岛市农业科学研究院蔬菜花卉研究所提供。选取饱满种子，催芽后播种在含草炭、蛭石和羊粪(体积比为3：2：1)的营养钵中。待植株长至7～8片真叶时，选长势一致者移至光照培养箱[光照强度55.63μmol/(m2·s)]进行温度胁迫。设25℃(CK)、40~C(高温)和5~C(低温)3个处理。均于处理的0、4、8、12、24和36 h，分别取幼苗顶端下第3～4片叶测定各项指标。每处理重复3次，样品经液氮冷冻后，－80℃超低温冰箱保存。
1.2 测定方法
1.2.1 酶活性测定 GaILDH和MDHAR活性分别采用Tabata等(2001)和Jim6nez等(1997)的方法测定；GR、APX活性参照Pignocchi等(2006)的方法测定。
DHAR活性参照Chen等(2003)的方法加以改进。取0.5 g番茄叶片在4 ml提取缓冲液(含50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，100 mmol/L NaCI，2 mmol/L EDTA和l mmol/L MgCl2)研磨匀浆，12 000×g离心10 min。取100μl提取液，加1.9 ml反应液(含25 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 7.0，0.1 mmol/L EDTA，3.5 mmol/L GSH，0.4 mmol/L DHA)。紫外分光光度计测定265 nm下吸光值变化。
1.2.2 AsA、DHA和AsA+DHA含量测定AsA含量测定参考Tures(myi等(2000)及Takahama和Onik(1992)提供的方法并作适当改进：称取约0.5 g番茄叶片在5％的偏磷酸中研磨匀浆，于4℃下12 000×g离心20 min，收集上清液用于测定AsA和DHA的含量。测定AsA时，吸取一定量的如上提取液加至100 mmol/L磷酸钾缓冲液2Inl(pH 6.8)中，当加入1 u的抗坏血酸氧化酶(EC 1.10.3.3，from Cucurbita sp.)后记录265nm下的吸光值变化。测定DHA时，吸取一定量提取液加至100 mmol/L磷酸钾缓冲液2 ml(pH6.8)中，当加入2 mmo~L DTr后开始记录265nm下的吸光值变化。同时，用一系列已知浓度的AsA和DHA(sigma)溶液用相同的方法作标准曲线以计算样品中AsA、DHA和AsA+DHA含量。
1.2.3 H2O2含量测定H2O2的测定参照Petrie和Jaekson(1984)的方法。
1.3 数据分析
采用Microsoft Excel软件分析数据和做图，采用DPS统计软件中的Duncan新复极差法对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 温度胁迫下AsA、DHA和AsA+DHA含量及AsA/DHA比值
如图1所示，CK(25℃)番茄叶片AsA含量变化不大，但40℃和5℃两者AsA含量均呈先增加后下降趋势，且均在胁迫的12 h达到高峰，分别较CK增加58.3％和33.3％，而后急剧下降。CK番茄叶片DHA含量变化不大，但40℃和5℃两处理DHA含量均呈先增加后下降趋势，且在胁迫的12 h达到高峰，分别较CK增加72.9％和61.6％，而后急剧下降，但40℃处理最终仍显著高于CK。AsA+DHA含量变化趋势与DHA含量基本一致；而AsA/DHA比值在40℃和s℃胁迫下。均始终明显低于CK。
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2.2 温度胁迫下GalLDH活性
如图2所示，40℃和5℃下，番茄叶片GalLDH活性变化基本一致，胁迫的4 h内均变化不大，但随后均急剧增加至12h达到高峰，分别比CK增加139.5％和113.3％，而后又急剧下降，36h时显著低于CK；但CK番茄叶片GalLDH活性在处理过程中变化很小。
2.3 温度胁迫下MDHAR和DHAR活性
如图3所示，40℃和5℃下，番茄叶片MDHAR活性具有相同的变化规律，均呈单峰曲线，在12 h达到高峰，分别比CK增加152.3％和130％。之后迅速下降，在36 h显著低于CK。 DHAR活性变化和MDHAR活性变化规律基本一致，在12 h达到最高值，分别比CK增加220.1％和173.8％，之后迅速下降。由图3可明显看出，CK番茄叶片MDHAR和DHAR活性在处理过程中均变化很小。
2.4 温度胁迫下APX活性
如图4所示，40％和5℃两处理的番茄叶片APX活性均始终明显高于CK，在8 h内两处理APX活性增加缓慢，随后增加迅速，在12 h达到高峰，分别比CK增加147％和155.8％，之后迅速下降，但36 h时仍显著高于CK。
2.5 温度胁迫下GR活性
由图5看出，40℃和5℃下，番茄叶片GR活性均逐渐增加，12 h达到高峰，分别比CK增加62.4％和36.7％，之后迅速下降，在36 h均显著低于CK，但CK番茄叶片GR活性在处理过程中变化很小。
2.6 温度胁迫下H2O2含量
如图6所示，40℃和5℃两处理的番茄叶片H2O2含量均始终明显高于CK，两者均快速增加，8h达到高峰，分别比CK增加47.6％和52.2％，12 h后明显下降，24 h后40℃处理H2O2含量又明显增加，而5℃处理变化不大。
3 讨论与结论
温度逆境对植物的伤害涉及到其体内一系列生理效应的变化，而活性氧的积累及其所引起的氧化胁迫被认为是植物受冷热伤害的重要原因。因此，作为植物体内重要的抗氧化物，抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)是植物体内普遍存在的一种高丰度小分子抗氧化物质，可以直接清除O2·)、H2O2和·OH等活性氧自由基(ROS)，其中一个重要功能是保护叶绿体免于氧化损伤，因此在植物抵抗生物和非生物胁迫中具有重要作用。相当多的研究资料表明，AsA的含量、氧化还原状态(AsA/DHA)及其合成代谢相关酶类活性的变化是植物对一系列环境胁迫的响应。本试验结果表明，番茄在高低温胁迫下，AsA含量及其代谢相关酶活性显著增加，说明以AsA为核心的抗氧化系统参与了清除活性氧，提高了番茄的抗性。
H2O2被认为是一种导致植物氧化胁迫的活性氧分子和植物细胞应答环境变化所产生的重要信号分子。本试验中，在高温和低温胁迫初期，番茄叶片H2O2含量均迅速增加，诱发了以AsA为核心的代谢相关酶活性的迅速增强，AsA及AsA库含量也逐渐增加。同时APX活性增强，AsA参与H2O2的清除被消耗，其最终产物DHA含量不断增加，AsA/DHA快速降低。说明在温度胁迫下，以AsA为核心的抗氧化酶系统参与了番茄抵御高温和低温逆境的自我保护反应，并通过调节AsA水平，保护植株抵御温度逆境引起的氧化伤害。H202含量在8～24 h的下降也体现了这一点(图6)。然而，随着胁迫时间的延长，GalLDH和DHAR活性以及MDHAR和GR活性于胁迫12 h后开始下降，表明以AsA为核心的抗氧化系统功能逐渐降低，AsA/DHA也开始下降。同时，AsA是APX维持活性清除H20z所必需的。AsA的缺乏，使得APX的活性在12 h后也急速下降，从而导致H202开始积累，诱发膜脂过氧化水平加剧。罗亚等(2007)在冷处理草莓和Ma等(2008)热处理苹果所测定的AsA代谢相关酶活性的变化也获得了相似的结果。
关键词：番茄；高温；低温；抗坏血酸；抗坏血酸系统
中图分类号：S641.201 文献标识号：A 文章编号：1001-4942(2010)04-0022-05
番茄属喜温不耐热的蔬菜，夏秋露地以及日光温室和大棚栽培，常遇35℃以上高温，往往导致其生育异常；番茄对低温也较敏感，8℃时生长发育严重受阻，5℃时生长完全停止。因此，温度逆境成为影响番茄产量和品质的主要因素之一。
高温和低温均会导致植物活性氧自由基积累，进而形成氧化胁迫。通过调节自身的抗氧化系统，植物可清除活性氧自由基而免受或减少伤害。以抗坏血酸(AsA)为核心的抗氧化系统在植物清除活性氧过程中具有重要的作用。植物AsA代谢途径已较为明确，AsA主要是通过半乳糖途径合成，L一半乳糖－1，4-内酯脱氢酶(GalLDH)为催化该途径最后一步反应的关键酶。AsA在抗坏血酸过氧化物酶(APX)作用下氧化生成单脱氢抗坏血酸(MDHA)。MDHA经非酶歧化反应形成脱氢抗坏血酸(DHA)。两者分别通过单脱氢抗坏血酸还原酶(MDHAR)和脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)、谷胱甘肽还原酶(GR)的作用被还原再生。因此，GalLDH、APX、MDHAR、DHAR和GR为影响AsA代谢的重要酶，并被证明参与植物对活性氧的清除作用。
目前，有关番茄在温度逆境下AsA代谢系统的变化尚未见报道。本试验以番茄幼苗为试材，旨在探明其在温度逆境下AsA代谢系统抗氧化的生理机制，以期为番茄在栽培中抵御温度胁迫提供理论指导。
1 材料与方法
1.1 供试材料
试材番茄品种为“S以12粉”，由青岛市农业科学研究院蔬菜花卉研究所提供。选取饱满种子，催芽后播种在含草炭、蛭石和羊粪(体积比为3：2：1)的营养钵中。待植株长至7～8片真叶时，选长势一致者移至光照培养箱[光照强度55.63μmol/(m2·s)]进行温度胁迫。设25℃(CK)、40~C(高温)和5~C(低温)3个处理。均于处理的0、4、8、12、24和36 h，分别取幼苗顶端下第3～4片叶测定各项指标。每处理重复3次，样品经液氮冷冻后，－80℃超低温冰箱保存。
1.2 测定方法
1.2.1 酶活性测定 GaILDH和MDHAR活性分别采用Tabata等(2001)和Jim6nez等(1997)的方法测定；GR、APX活性参照Pignocchi等(2006)的方法测定。
DHAR活性参照Chen等(2003)的方法加以改进。取0.5 g番茄叶片在4 ml提取缓冲液(含50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，100 mmol/L NaCI，2 mmol/L EDTA和l mmol/L MgCl2)研磨匀浆，12 000×g离心10 min。取100μl提取液，加1.9 ml反应液(含25 mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 7.0，0.1 mmol/L EDTA，3.5 mmol/L GSH，0.4 mmol/L DHA)。紫外分光光度计测定265 nm下吸光值变化。
1.2.2 AsA、DHA和AsA+DHA含量测定AsA含量测定参考Tures(myi等(2000)及Takahama和Onik(1992)提供的方法并作适当改进：称取约0.5 g番茄叶片在5％的偏磷酸中研磨匀浆，于4℃下12 000×g离心20 min，收集上清液用于测定AsA和DHA的含量。测定AsA时，吸取一定量的如上提取液加至100 mmol/L磷酸钾缓冲液2Inl(pH 6.8)中，当加入1 u的抗坏血酸氧化酶(EC 1.10.3.3，from Cucurbita sp.)后记录265nm下的吸光值变化。测定DHA时，吸取一定量提取液加至100 mmol/L磷酸钾缓冲液2 ml(pH6.8)中，当加入2 mmo~L DTr后开始记录265nm下的吸光值变化。同时，用一系列已知浓度的AsA和DHA(sigma)溶液用相同的方法作标准曲线以计算样品中AsA、DHA和AsA+DHA含量。
1.2.3 H2O2含量测定H2O2的测定参照Petrie和Jaekson(1984)的方法。
1.3 数据分析
采用Microsoft Excel软件分析数据和做图，采用DPS统计软件中的Duncan新复极差法对数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 温度胁迫下AsA、DHA和AsA+DHA含量及AsA/DHA比值
如图1所示，CK(25℃)番茄叶片AsA含量变化不大，但40℃和5℃两者AsA含量均呈先增加后下降趋势，且均在胁迫的12 h达到高峰，分别较CK增加58.3％和33.3％，而后急剧下降。CK番茄叶片DHA含量变化不大，但40℃和5℃两处理DHA含量均呈先增加后下降趋势，且在胁迫的12 h达到高峰，分别较CK增加72.9％和61.6％，而后急剧下降，但40℃处理最终仍显著高于CK。AsA+DHA含量变化趋势与DHA含量基本一致；而AsA/DHA比值在40℃和s℃胁迫下。均始终明显低于CK。
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2.2 温度胁迫下GalLDH活性
如图2所示，40℃和5℃下，番茄叶片GalLDH活性变化基本一致，胁迫的4 h内均变化不大，但随后均急剧增加至12h达到高峰，分别比CK增加139.5％和113.3％，而后又急剧下降，36h时显著低于CK；但CK番茄叶片GalLDH活性在处理过程中变化很小。
2.3 温度胁迫下MDHAR和DHAR活性
如图3所示，40℃和5℃下，番茄叶片MDHAR活性具有相同的变化规律，均呈单峰曲线，在12 h达到高峰，分别比CK增加152.3％和130％。之后迅速下降，在36 h显著低于CK。 DHAR活性变化和MDHAR活性变化规律基本一致，在12 h达到最高值，分别比CK增加220.1％和173.8％，之后迅速下降。由图3可明显看出，CK番茄叶片MDHAR和DHAR活性在处理过程中均变化很小。
2.4 温度胁迫下APX活性
如图4所示，40％和5℃两处理的番茄叶片APX活性均始终明显高于CK，在8 h内两处理APX活性增加缓慢，随后增加迅速，在12 h达到高峰，分别比CK增加147％和155.8％，之后迅速下降，但36 h时仍显著高于CK。
2.5 温度胁迫下GR活性
由图5看出，40℃和5℃下，番茄叶片GR活性均逐渐增加，12 h达到高峰，分别比CK增加62.4％和36.7％，之后迅速下降，在36 h均显著低于CK，但CK番茄叶片GR活性在处理过程中变化很小。
2.6 温度胁迫下H2O2含量
如图6所示，40℃和5℃两处理的番茄叶片H2O2含量均始终明显高于CK，两者均快速增加，8h达到高峰，分别比CK增加47.6％和52.2％，12 h后明显下降，24 h后40℃处理H2O2含量又明显增加，而5℃处理变化不大。
3 讨论与结论
温度逆境对植物的伤害涉及到其体内一系列生理效应的变化，而活性氧的积累及其所引起的氧化胁迫被认为是植物受冷热伤害的重要原因。因此，作为植物体内重要的抗氧化物，抗坏血酸(ascorbic acid，AsA)是植物体内普遍存在的一种高丰度小分子抗氧化物质，可以直接清除O2·)、H2O2和·OH等活性氧自由基(ROS)，其中一个重要功能是保护叶绿体免于氧化损伤，因此在植物抵抗生物和非生物胁迫中具有重要作用。相当多的研究资料表明，AsA的含量、氧化还原状态(AsA/DHA)及其合成代谢相关酶类活性的变化是植物对一系列环境胁迫的响应。本试验结果表明，番茄在高低温胁迫下，AsA含量及其代谢相关酶活性显著增加，说明以AsA为核心的抗氧化系统参与了清除活性氧，提高了番茄的抗性。
H2O2被认为是一种导致植物氧化胁迫的活性氧分子和植物细胞应答环境变化所产生的重要信号分子。本试验中，在高温和低温胁迫初期，番茄叶片H2O2含量均迅速增加，诱发了以AsA为核心的代谢相关酶活性的迅速增强，AsA及AsA库含量也逐渐增加。同时APX活性增强，AsA参与H2O2的清除被消耗，其最终产物DHA含量不断增加，AsA/DHA快速降低。说明在温度胁迫下，以AsA为核心的抗氧化酶系统参与了番茄抵御高温和低温逆境的自我保护反应，并通过调节AsA水平，保护植株抵御温度逆境引起的氧化伤害。H202含量在8～24 h的下降也体现了这一点(图6)。然而，随着胁迫时间的延长，GalLDH和DHAR活性以及MDHAR和GR活性于胁迫12 h后开始下降，表明以AsA为核心的抗氧化系统功能逐渐降低，AsA/DHA也开始下降。同时，AsA是APX维持活性清除H20z所必需的。AsA的缺乏，使得APX的活性在12 h后也急速下降，从而导致H202开始积累，诱发膜脂过氧化水平加剧。罗亚等(2007)在冷处理草莓和Ma等(2008)热处理苹果所测定的AsA代谢相关酶活性的变化也获得了相似的结果。