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【摘 要】 目的：建立维药睡莲花药材中没食子酸的含量测定方法，为其质量控制提供科学依据。方法：采用HPLC法测定，色谱条件：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250mm × 46mm，5μm），流动相为甲醇：005ml/l磷酸二元梯度洗脱，流速：10ml/min，柱温：30 ℃，检测波长为273nm。结果：没食子酸在000196～00784mg/ml的范围内与峰面积呈良好的线性关系（r=09999），加样回收率为9812%，RSD为179%（n=6）；样品溶液在32h内稳定。结论：该方法操作简便、重复性好，可用于规范和控制维药睡莲花药材的质量。
【关键词】 睡莲花；没食子酸；高效液相色谱法；含量测定
【中图分类号】R2841 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）24-0006-03
Determination of gallic acid content of Nymphaea Candida
LI Chenyang，ZHAO Jun，XU Fang，TAN Wei，CHEN Yan
Xinjiang Institute of Materia Medica，Key Laboratory of Uighur Medicine，Urumqi 830004，China
Abstract：Objective To establish the determination method of Nymphaea candida Presl. for determining gallic acid with HPLC. Method The HPLC separation was performed on a Agilent Eclipse XDB-C18 column（250mm×46mm，5μm） in gradient elute mode with a mixture consisting of methol and 05ml/L phosphate acid solution at 30°C， the flow rate was 10ml/min， the detection wavelength was set at 273nm. Result The calibration curve of gallic acid was linear in the range of 000196～00784mg/ml （r=09999）； the average recovery of quercitrin was 9812% （RSD=179%，n=6），and the properties of sample solution kept steady within 32 hours. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the quality control of Nymphaea candida Presl.
Keywords：Nymphaea candida Presl；gallic acid；HPLC；determination
睡莲花（Nymphaea candida Presl.）为睡莲科睡莲属多年生水生草本植物雪白睡莲的干燥花蕾，具有清热解毒、镇静安神之功效，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册》，是维吾尔医常用的单方或复方抗病毒药中的主要成分。该药材在维吾尔医中用药历史久远，主要用于热症引起的头痛，热感咳嗽及小儿急、慢惊风等病症的治疗。睡莲属植物大部分原产北非和东南亚热带地区，少数产于南非、欧洲和亚洲的温带和寒带地区，国内从云南至东北，往西至新疆均有分布。本论文采用高效液相色谱法测定了睡莲花中没食子酸的含量，为后期睡莲花质量控制的提高和开发利用提供科学依据。
1 仪器与试药
11 仪器 LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外可见检测器（日本岛津有限公司）；梅特勒AL204型电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；HH-W600三用恒温水箱（江苏金坛市医疗仪器厂）；AS10200AD型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。
12 试药 没食子酸对照品（批号：110831-200302，中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇为色谱纯（Fisher）；水为娃哈哈纯净水；磷酸等其他试剂为分析纯。雪白睡莲药材经新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定为雪白睡莲Nymphaea candida Presl.的干燥花蕾。
2 方法与结果
21 色谱条件与系统适用性
211 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250mm×46mm，5μm）；，流动相：甲醇-05ml/L磷酸（5：95）；流速：10ml/min；柱温：30℃；检测波长：273nm；进样量：10μl。
212 色谱适用性试验 没食子酸理论塔板数 n=554（tR/Wh/2）2 =7577，说明在选定的条件下，色谱柱的某些条件如柱长、载体性能及色谱柱填充均符合要求，测定效果良好。没食子酸分离度 R=2（tR2-tR1）/（W1+W2） = 460，《中国药典》（2010版）规定分离度应大于15，本项结果表明，分离度符合要求。在上述色谱条件下，药材中没食子酸的色谱峰与其它成分分离度良好。结果见图1。
22 供试品溶液的制备 取睡莲花药材（批号20130108），粉碎过40目筛，取01g，精密称定，置50ml量瓶中，加入体积分数为60%的甲醇30ml，超声提取30min，放至室温，加体积分数为60%的甲醇定容至刻度，用微孔滤膜（045μm）过滤，取续滤液作为供试品溶液。 23 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0196mg的没食子酸对照品储备溶液。
24 线性关系考察 没食子酸线性关系考察 精密量取没食子酸对照品溶液01、02、05、1、2、4ml，分别置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取各对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，得没食子酸标准曲线方程Y=3071636768X525638，r=09999，结果表明，没食子酸在00019600784mg/ml范围内线性关系良好。
25 日内及日间精密度实验 取同一份睡莲花药材（批号20130108）的供试品溶液连续进样6次测定，结果没食子酸的RSD为073%，表明本方法精密度良好。将上述药材连续六天，在相同时间段取样处理并进样测定，结果睡莲花药材中没食子酸平均含量为416mg/g，RSD为262%。
26 重复性实验 准确称取睡莲花药材（批号20130108）粉末6 份，按所确定的样品制备方法和色谱条件测定，结果睡莲花药材中没食子酸的平均含量为418mg/g，RSD为213%，表明本方法重复性较好。
27 稳定性实验 取同一份睡莲花药材（批号20130108）的供试品溶液，分别在0、1、3、7、24、32h进样测定，结果睡莲花药材中没食子酸的峰面积RSD为072%，表明供试品溶液在32h内稳定性符合测试要求。
28 回收率测定 分别精密称取已测含量的睡莲花（批号20130108）粉末6 份，每份约005g，分别加入浓度为0196mg/ml的没食子酸对照品溶液11ml，再加入体积分数为60%的甲醇30ml，后按“22”项下供试品溶液的制备进行操作，结果见表1。没食子酸平均回收率为9812%，RSD为179%。
29 五批样品的含量测定 详见表2。
3 讨论
在流动相选择中，考察了甲醇-水溶液和乙腈-水溶液，结果表明水系统对没食子酸的分离度较差，且峰形不好；进而考察了甲醇-005%磷酸水溶液、甲醇-01%磷酸水溶液、甲醇-02%磷酸水溶液、乙腈醇-005%磷酸水溶液、乙腈醇-01%磷酸水溶液和乙腈醇-02%磷酸水溶液的梯度洗脱系统，结果表明甲醇、乙腈及不同浓度的磷酸水溶液对睡莲花样品中没食子酸的分离度和峰形都很好，因此从节约成本及保护色谱柱的方面考虑含量测定采用甲醇-005%磷酸水溶液系统。
提取方法的考察中加热回流法考察了不同提取溶剂、不同提取次数、不同提取时间及不同溶剂倍数，确定加热回流法的最佳提取方法是01g药材加入30ml水，加热回流两次每次15h。超声提取法同样考察不同提取溶剂、不同提取时间及不同溶剂倍数，确定超声提取法的最佳提取方法是01g药材加入30ml60%甲醇，超声05h。
综合样品稳定性以及节约时间的考虑，确定睡莲花中没食子酸含测样品的制备方法为01g药材加入30ml60%甲醇，超声05h。
（上接第7页）
本研究采用HPLC测定了5批次不同产地睡莲花药材中没食子酸的含量，由于新疆的湖泊数量和面积较少，加之睡莲花样品是未开放的花苞，采收的经济利益较低，所以采集较为困难，故本文收集了五批新疆地产的睡莲花药材样品进行测定。结果表明各产地没食子酸含量差异较大，说明不同批次的睡莲花药材的化学成分含量有差异，这可能是受气候、环境和土壤等因素的影响。实验结果为维药睡莲花质量标准的提高及规范睡莲花药材市场提供了理论依据。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册[J].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：111.
[2]赵军，徐芳，吉腾飞，等.雪白睡莲花酚类成分研究[J].天然产物研究与开发，2013，25（7）： 916-918.
[3]盛萍，帕丽达·阿不力孜，张烃，等.维吾尔药睡莲花中烟花苷的含量测定[J].中药材，2006，12（12）：1313-1314.
[4]赵军，贺金华，闫明，等.维药睡莲花化学成分研究[J].中国药学杂志，2007，32（12）：1232-1234.
[5]赵军，闫明，贺金华，等.维药睡莲花中的黄酮醇苷类成分分析[J].中国现代应用药学杂志，2008，25（2）：115-117.
[6]贺金华，赵军，闫明，等.睡莲花总酚酸超声提取工艺研究[J].时珍国医国药，2007，18（10）：2360-2361.
（收稿日期：20140929）
【关键词】 睡莲花；没食子酸；高效液相色谱法；含量测定
【中图分类号】R2841 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2014）24-0006-03
Determination of gallic acid content of Nymphaea Candida
LI Chenyang，ZHAO Jun，XU Fang，TAN Wei，CHEN Yan
Xinjiang Institute of Materia Medica，Key Laboratory of Uighur Medicine，Urumqi 830004，China
Abstract：Objective To establish the determination method of Nymphaea candida Presl. for determining gallic acid with HPLC. Method The HPLC separation was performed on a Agilent Eclipse XDB-C18 column（250mm×46mm，5μm） in gradient elute mode with a mixture consisting of methol and 05ml/L phosphate acid solution at 30°C， the flow rate was 10ml/min， the detection wavelength was set at 273nm. Result The calibration curve of gallic acid was linear in the range of 000196～00784mg/ml （r=09999）； the average recovery of quercitrin was 9812% （RSD=179%，n=6），and the properties of sample solution kept steady within 32 hours. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the quality control of Nymphaea candida Presl.
Keywords：Nymphaea candida Presl；gallic acid；HPLC；determination
睡莲花（Nymphaea candida Presl.）为睡莲科睡莲属多年生水生草本植物雪白睡莲的干燥花蕾，具有清热解毒、镇静安神之功效，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准维吾尔药分册》，是维吾尔医常用的单方或复方抗病毒药中的主要成分。该药材在维吾尔医中用药历史久远，主要用于热症引起的头痛，热感咳嗽及小儿急、慢惊风等病症的治疗。睡莲属植物大部分原产北非和东南亚热带地区，少数产于南非、欧洲和亚洲的温带和寒带地区，国内从云南至东北，往西至新疆均有分布。本论文采用高效液相色谱法测定了睡莲花中没食子酸的含量，为后期睡莲花质量控制的提高和开发利用提供科学依据。
1 仪器与试药
11 仪器 LC-10ATvp高效液相色谱仪，SPD-10Avp紫外可见检测器（日本岛津有限公司）；梅特勒AL204型电子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；HH-W600三用恒温水箱（江苏金坛市医疗仪器厂）；AS10200AD型超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。
12 试药 没食子酸对照品（批号：110831-200302，中国食品药品检定研究院）；乙腈、甲醇为色谱纯（Fisher）；水为娃哈哈纯净水；磷酸等其他试剂为分析纯。雪白睡莲药材经新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定为雪白睡莲Nymphaea candida Presl.的干燥花蕾。
2 方法与结果
21 色谱条件与系统适用性
211 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250mm×46mm，5μm）；，流动相：甲醇-05ml/L磷酸（5：95）；流速：10ml/min；柱温：30℃；检测波长：273nm；进样量：10μl。
212 色谱适用性试验 没食子酸理论塔板数 n=554（tR/Wh/2）2 =7577，说明在选定的条件下，色谱柱的某些条件如柱长、载体性能及色谱柱填充均符合要求，测定效果良好。没食子酸分离度 R=2（tR2-tR1）/（W1+W2） = 460，《中国药典》（2010版）规定分离度应大于15，本项结果表明，分离度符合要求。在上述色谱条件下，药材中没食子酸的色谱峰与其它成分分离度良好。结果见图1。
22 供试品溶液的制备 取睡莲花药材（批号20130108），粉碎过40目筛，取01g，精密称定，置50ml量瓶中，加入体积分数为60%的甲醇30ml，超声提取30min，放至室温，加体积分数为60%的甲醇定容至刻度，用微孔滤膜（045μm）过滤，取续滤液作为供试品溶液。 23 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0196mg的没食子酸对照品储备溶液。
24 线性关系考察 没食子酸线性关系考察 精密量取没食子酸对照品溶液01、02、05、1、2、4ml，分别置10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。精密吸取各对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归，得没食子酸标准曲线方程Y=3071636768X525638，r=09999，结果表明，没食子酸在00019600784mg/ml范围内线性关系良好。
25 日内及日间精密度实验 取同一份睡莲花药材（批号20130108）的供试品溶液连续进样6次测定，结果没食子酸的RSD为073%，表明本方法精密度良好。将上述药材连续六天，在相同时间段取样处理并进样测定，结果睡莲花药材中没食子酸平均含量为416mg/g，RSD为262%。
26 重复性实验 准确称取睡莲花药材（批号20130108）粉末6 份，按所确定的样品制备方法和色谱条件测定，结果睡莲花药材中没食子酸的平均含量为418mg/g，RSD为213%，表明本方法重复性较好。
27 稳定性实验 取同一份睡莲花药材（批号20130108）的供试品溶液，分别在0、1、3、7、24、32h进样测定，结果睡莲花药材中没食子酸的峰面积RSD为072%，表明供试品溶液在32h内稳定性符合测试要求。
28 回收率测定 分别精密称取已测含量的睡莲花（批号20130108）粉末6 份，每份约005g，分别加入浓度为0196mg/ml的没食子酸对照品溶液11ml，再加入体积分数为60%的甲醇30ml，后按“22”项下供试品溶液的制备进行操作，结果见表1。没食子酸平均回收率为9812%，RSD为179%。
29 五批样品的含量测定 详见表2。
3 讨论
在流动相选择中，考察了甲醇-水溶液和乙腈-水溶液，结果表明水系统对没食子酸的分离度较差，且峰形不好；进而考察了甲醇-005%磷酸水溶液、甲醇-01%磷酸水溶液、甲醇-02%磷酸水溶液、乙腈醇-005%磷酸水溶液、乙腈醇-01%磷酸水溶液和乙腈醇-02%磷酸水溶液的梯度洗脱系统，结果表明甲醇、乙腈及不同浓度的磷酸水溶液对睡莲花样品中没食子酸的分离度和峰形都很好，因此从节约成本及保护色谱柱的方面考虑含量测定采用甲醇-005%磷酸水溶液系统。
提取方法的考察中加热回流法考察了不同提取溶剂、不同提取次数、不同提取时间及不同溶剂倍数，确定加热回流法的最佳提取方法是01g药材加入30ml水，加热回流两次每次15h。超声提取法同样考察不同提取溶剂、不同提取时间及不同溶剂倍数，确定超声提取法的最佳提取方法是01g药材加入30ml60%甲醇，超声05h。
综合样品稳定性以及节约时间的考虑，确定睡莲花中没食子酸含测样品的制备方法为01g药材加入30ml60%甲醇，超声05h。
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本研究采用HPLC测定了5批次不同产地睡莲花药材中没食子酸的含量，由于新疆的湖泊数量和面积较少，加之睡莲花样品是未开放的花苞，采收的经济利益较低，所以采集较为困难，故本文收集了五批新疆地产的睡莲花药材样品进行测定。结果表明各产地没食子酸含量差异较大，说明不同批次的睡莲花药材的化学成分含量有差异，这可能是受气候、环境和土壤等因素的影响。实验结果为维药睡莲花质量标准的提高及规范睡莲花药材市场提供了理论依据。
参考文献
[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准：维吾尔药分册[J].乌鲁木齐：新疆科技卫生出版社，1999：111.
[2]赵军，徐芳，吉腾飞，等.雪白睡莲花酚类成分研究[J].天然产物研究与开发，2013，25（7）： 916-918.
[3]盛萍，帕丽达·阿不力孜，张烃，等.维吾尔药睡莲花中烟花苷的含量测定[J].中药材，2006，12（12）：1313-1314.
[4]赵军，贺金华，闫明，等.维药睡莲花化学成分研究[J].中国药学杂志，2007，32（12）：1232-1234.
[5]赵军，闫明，贺金华，等.维药睡莲花中的黄酮醇苷类成分分析[J].中国现代应用药学杂志，2008，25（2）：115-117.
[6]贺金华，赵军，闫明，等.睡莲花总酚酸超声提取工艺研究[J].时珍国医国药，2007，18（10）：2360-2361.
（收稿日期：20140929）