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摘 要:食品中合成着色剂高效液相色谱的测定。方法采用C18(10€%em,4.6mm€?50mm)不锈钢色谱柱，流动相为乙酸铵+甲醇，流速1.0mL/min，检测波长254nm，柱温设为23℃，进样量20€%eL。本检测方法对GB/T5009.35-2003食品中合成着色剂的测定进一步细化，使用着色剂小柱代替GB/T5009.35-2003食品中合成着色剂的测定中色素提取，检测时间缩短，检测结果精确度提高，具有一定的实践指导作用。
关键词:食品 合成着色剂
1、前言
食品中合成着色剂是一种已知的有害物质，其随食物被摄入人体内后,很快被肠道吸收。由于着色剂在人体中具有累积作用,长期过量摄入直接危害到人们的健康特别是对少年儿童的健康危害更为严重，孩子的肝脏解毒和代谢功能都比较脆弱，如果摄入过多的人工合成色素，会加重肝脏及胃肠道的负担，干扰体内正常的代谢反应，出现不同程度的食欲不振、消化不良、腹痛、腹泻等症状
2、原理
样品经水溶解，通过活化的着色剂小柱吸附色素，用洗脱试剂洗脱，用高效液相色谱分离，紫外检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。
3、试验部分
3.1所用试剂
3.1.1水：符合GB/T6682规定的一级水要求
3.1.2 甲醇：色谱纯。
3.1.3 氨水：分析纯
3.1.4乙酸铵溶液（0.02moL/L）：称取1.54g乙酸铵加水至1000mL溶解，经0.45€%em滤膜过滤
3.1.5标准品：柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、亮蓝
3.1.6氨化甲醇5%：95mL甲醇加5mL氨水
3.2仪器与设备
3.2.1高效液相色谱仪
3.2.2色谱工作站
3.2.3紫外检测器
3.2.4 C18(10€%em,4.6mm€?50mm)不锈钢色谱柱
3.2.5固相萃取装置
3.2.6着色剂小柱
3.2.7氮吹仪
3.2.8漩涡混合器
3.2.9高速离心机
3.3方法
3.3.1合成着色剂标准溶液浓度的配制
准确称取标准品着色剂各100mg,置于100 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,该贮备液浓度1mg/mL。配制50.0€%eg/mL混合使用液，准确吸取储备液各5.0 mL于100 mL容量瓶用水定容至刻度。
3.3.2样品预处理
桔子汁、果味水等：称取20.00g～40.00g，放入100ml烧杯中，含二氧化碳的试样加热驱除二氧化碳
配制酒类：称取20.00g～40.00g，放入100ml烧杯中，加小碎瓷片数片加热驱除乙醇。
硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等：称取5.00g～40.00g粉碎试样放入100ml烧杯中，加30ml水，温热溶解，若试样溶液PH值较高，用柠檬酸 调PH值到6左右。
巧克力及着色糖衣制品：称取5.00g～10.00g，放入100ml烧杯中，用水反复洗涤色素，到试样无色素为止，合并色素漂洗液为试样溶液。
3.3.3 色素提取
聚酞胺吸附法：样品溶液加柠檬酸溶液调pH值到6，加热至60℃，将1g聚酞胺粉加少许水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃pH=4的水洗涤3～5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3～5次再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL经滤膜(0．45€%em)过滤，取10€%eL进高效液相色谱仪。
液-液分配法(适用于含赤藓红的样品)：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2mL盐酸、三正辛胺正丁醇溶液(5％)10～20mL，振摇提取，分取有机相，重复提取，至到有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10mL，分取有机相，放蒸发皿中，水浴加热浓缩至10mL，转移至分液漏斗中，加60mL正己烷，混匀，加氨水提取2～3次，每次5mL合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素)，用正己烷洗2次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL经滤膜(0.45€%em)过滤，取10€%eL进高效液相色谱仪。
3.3.4色谱条件
流动相:A相为乙酸铵溶液,B相为甲醇；梯度洗脱：甲醇20%～35%，3%/min;35%～98%,9%/min;98%继续保持6 min。流速1.0mL/min;柱温23℃,进样20€%eL;紫外检测波长为254nm;以色谱峰面积外标法定量。在此条件下，测得保留时间，样品溶液中主峰和其它杂峰达到完全分离。
3.3.5样品的测定
用干净的25mL比色管称取混匀试样约5g，加少量水混匀溶解静置过夜。用水定容至刻度，离心10min。加3mL甲醇3mL水活化着色剂小柱，注意此时不要干柱应立即向着色剂小柱加入5mL样品，加3mL水3mL甲醇进行淋洗，然后加2mL5%氨化甲醇进行解析，着色剂小柱下接塑料小试管收集解析液。氮吹仪吹干塑料小试管，注意氮气流量不要开太大以免把样液吹出。再加1mL水，在混匀器上混匀1min，此时注意混匀时样液不要触碰试管盖，处理好进样备用。
3.4样品测定结果
取试样溶液20€%eL,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,获取峰面积,用外标法进行计算，获得合成着色剂含量结果。
4、结果与分析
4.1线性关系考察
在3.3.2色谱条件下,将不同浓度的标准工作液依次从低浓度到高浓度进样,以对照品溶液浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线,并计算标准曲线的回归方程及相关系数。其线性回归方程为：Y=2€?08X+31012,相关系数R=0.9992,其结果表明线性良好。
4.2檢测限考察及方法精密度实验
以产生信号(峰高)为基线噪音标准差3倍的样品浓度作为该方法的检出限即0.24mg/kg。以同一加标的样品重复测定5次，测得其峰面积的RSD为2.68%，表明本法的精密度良好。
4.3回收率实验
为考察方法的准确度,以现场样品中加入低、中、高三种含量的标准液,然后测定样品溶液和标准溶液计算加标回收率,设计10€%eg、25€%eg、50€%eg三个添加浓度,每个浓度作为2平行,测得回收率为98%。
5、本文测定方法特点
5.1对国家标准GB/T5009.35-2003食品中合成着色剂的测定检测步骤上进行了取代，比如3.3.3中的色素提取用着色剂小柱代替，节省了检测时间，该方法经过反复试验总结而来。对食品测定合成着色剂实际操作具有一定的指导作用。
5.2在液相色谱仪上设置梯度洗脱条件时，20%～35%，3%/min需要5min; 3%/min,35%～98%需要7min; 98%继续保持6 min,总共18min采集完毕。梯度洗脱条件对样品检测结果的准确性非常重要，因此色谱峰的分离重在色谱条件上。
参考文献:
[1]GB/T5009.35-2003食品中合成着色剂的测定
关键词:食品 合成着色剂
1、前言
食品中合成着色剂是一种已知的有害物质，其随食物被摄入人体内后,很快被肠道吸收。由于着色剂在人体中具有累积作用,长期过量摄入直接危害到人们的健康特别是对少年儿童的健康危害更为严重，孩子的肝脏解毒和代谢功能都比较脆弱，如果摄入过多的人工合成色素，会加重肝脏及胃肠道的负担，干扰体内正常的代谢反应，出现不同程度的食欲不振、消化不良、腹痛、腹泻等症状
2、原理
样品经水溶解，通过活化的着色剂小柱吸附色素，用洗脱试剂洗脱，用高效液相色谱分离，紫外检测器检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量。
3、试验部分
3.1所用试剂
3.1.1水：符合GB/T6682规定的一级水要求
3.1.2 甲醇：色谱纯。
3.1.3 氨水：分析纯
3.1.4乙酸铵溶液（0.02moL/L）：称取1.54g乙酸铵加水至1000mL溶解，经0.45€%em滤膜过滤
3.1.5标准品：柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、亮蓝
3.1.6氨化甲醇5%：95mL甲醇加5mL氨水
3.2仪器与设备
3.2.1高效液相色谱仪
3.2.2色谱工作站
3.2.3紫外检测器
3.2.4 C18(10€%em,4.6mm€?50mm)不锈钢色谱柱
3.2.5固相萃取装置
3.2.6着色剂小柱
3.2.7氮吹仪
3.2.8漩涡混合器
3.2.9高速离心机
3.3方法
3.3.1合成着色剂标准溶液浓度的配制
准确称取标准品着色剂各100mg,置于100 mL量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,该贮备液浓度1mg/mL。配制50.0€%eg/mL混合使用液，准确吸取储备液各5.0 mL于100 mL容量瓶用水定容至刻度。
3.3.2样品预处理
桔子汁、果味水等：称取20.00g～40.00g，放入100ml烧杯中，含二氧化碳的试样加热驱除二氧化碳
配制酒类：称取20.00g～40.00g，放入100ml烧杯中，加小碎瓷片数片加热驱除乙醇。
硬糖、蜜饯类、淀粉软糖等：称取5.00g～40.00g粉碎试样放入100ml烧杯中，加30ml水，温热溶解，若试样溶液PH值较高，用柠檬酸 调PH值到6左右。
巧克力及着色糖衣制品：称取5.00g～10.00g，放入100ml烧杯中，用水反复洗涤色素，到试样无色素为止，合并色素漂洗液为试样溶液。
3.3.3 色素提取
聚酞胺吸附法：样品溶液加柠檬酸溶液调pH值到6，加热至60℃，将1g聚酞胺粉加少许水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌片刻，以G3垂融漏斗抽滤，用60℃pH=4的水洗涤3～5次，然后用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3～5次再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，每次5mL收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5mL经滤膜(0．45€%em)过滤，取10€%eL进高效液相色谱仪。
液-液分配法(适用于含赤藓红的样品)：将制备好的样品溶液放入分液漏斗中，加2mL盐酸、三正辛胺正丁醇溶液(5％)10～20mL，振摇提取，分取有机相，重复提取，至到有机相无色，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10mL，分取有机相，放蒸发皿中，水浴加热浓缩至10mL，转移至分液漏斗中，加60mL正己烷，混匀，加氨水提取2～3次，每次5mL合并氨水溶液层(含水溶性酸性色素)，用正己烷洗2次，氨水层加乙酸调成中性，水浴加热蒸发至近干，加水定容至5mL经滤膜(0.45€%em)过滤，取10€%eL进高效液相色谱仪。
3.3.4色谱条件
流动相:A相为乙酸铵溶液,B相为甲醇；梯度洗脱：甲醇20%～35%，3%/min;35%～98%,9%/min;98%继续保持6 min。流速1.0mL/min;柱温23℃,进样20€%eL;紫外检测波长为254nm;以色谱峰面积外标法定量。在此条件下，测得保留时间，样品溶液中主峰和其它杂峰达到完全分离。
3.3.5样品的测定
用干净的25mL比色管称取混匀试样约5g，加少量水混匀溶解静置过夜。用水定容至刻度，离心10min。加3mL甲醇3mL水活化着色剂小柱，注意此时不要干柱应立即向着色剂小柱加入5mL样品，加3mL水3mL甲醇进行淋洗，然后加2mL5%氨化甲醇进行解析，着色剂小柱下接塑料小试管收集解析液。氮吹仪吹干塑料小试管，注意氮气流量不要开太大以免把样液吹出。再加1mL水，在混匀器上混匀1min，此时注意混匀时样液不要触碰试管盖，处理好进样备用。
3.4样品测定结果
取试样溶液20€%eL,注入高效液相色谱仪,记录色谱图,获取峰面积,用外标法进行计算，获得合成着色剂含量结果。
4、结果与分析
4.1线性关系考察
在3.3.2色谱条件下,将不同浓度的标准工作液依次从低浓度到高浓度进样,以对照品溶液浓度为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线,并计算标准曲线的回归方程及相关系数。其线性回归方程为：Y=2€?08X+31012,相关系数R=0.9992,其结果表明线性良好。
4.2檢测限考察及方法精密度实验
以产生信号(峰高)为基线噪音标准差3倍的样品浓度作为该方法的检出限即0.24mg/kg。以同一加标的样品重复测定5次，测得其峰面积的RSD为2.68%，表明本法的精密度良好。
4.3回收率实验
为考察方法的准确度,以现场样品中加入低、中、高三种含量的标准液,然后测定样品溶液和标准溶液计算加标回收率,设计10€%eg、25€%eg、50€%eg三个添加浓度,每个浓度作为2平行,测得回收率为98%。
5、本文测定方法特点
5.1对国家标准GB/T5009.35-2003食品中合成着色剂的测定检测步骤上进行了取代，比如3.3.3中的色素提取用着色剂小柱代替，节省了检测时间，该方法经过反复试验总结而来。对食品测定合成着色剂实际操作具有一定的指导作用。
5.2在液相色谱仪上设置梯度洗脱条件时，20%～35%，3%/min需要5min; 3%/min,35%～98%需要7min; 98%继续保持6 min,总共18min采集完毕。梯度洗脱条件对样品检测结果的准确性非常重要，因此色谱峰的分离重在色谱条件上。
参考文献:
[1]GB/T5009.35-2003食品中合成着色剂的测定