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摘要：目的 观察对药陈皮半夏对颈动脉粥样硬化家兔血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的干预作用，探讨抗动脉硬化的作用机制。方法 将25只雄性新西兰白兔随机分为正常组、模型组和中药大、中、小剂量组。正常组给予基础饲料喂饲，模型组和中药组予高脂饲料喂饲，并在喂饲1周后实施颈动脉内膜空气干燥术，术后中药组按10、8、6 mL/kg剂量予陈皮半夏煎剂灌胃，每日1次。4周后处死家兔，取每只家兔右侧颈动脉远端1 cm，固定后行HE染色，观察病理改变。应用免疫组化SABC法检测VCAM-1和MMP-9表达情况。结果 模型组血管壁泡沫细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的胞浆中有VCAM-1和MMP-9强阳性表达，显著高于正常组（P<0.01）。中药组细胞内VCAM-1和MMP-9阳性表达显著低于模型组（P<0.01），且随剂量的增加，陈皮半夏煎剂对VCAM-1和MMP-9的抑制逐渐增强。结论 对药陈皮半夏可以有效抑制颈动脉硬化家兔VCAM-1和MMP-9的表达，提示其可能是通过抑制血管炎症反应、稳定斑块而发挥抗颈动脉硬化作用的。
关键词：陈皮；半夏；颈动脉硬化；血管细胞黏附分子-1；基质金属蛋白酶-9；兔
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.11.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）11-0034-03
颈动脉硬化是全身性动脉硬化的一部分，其病因尚未完全阐明。流行病学调查显示其主要危险因素有年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病及高血脂症等。目前学者普遍认为颈动脉硬化是由于致伤因素和血管反应之间复杂的相互作用的结果[1]。颈动脉硬化的形成悄无声息，但它是引起脑梗死的重要危险因素。严重颈动脉硬化者即使在药物的干预下，脑卒中的发生率仍为15%～20%[2]。颈动脉硬化形成过程中，血管细胞黏附分子-1
基金项目：国家自然科学基金（30801481，81102624）；北京市科技新星项目（2008A090）；北京市中医药科技项目（JJ2009-037）
通讯作者：黄小波，E-mail：huangxiaobo@bjgn.org
（VCAM-1）介导的炎症反应和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）对动脉硬化斑块的稳定等起到了极其重要的作用[3-4]。本课题组前期研究中发现化痰法能有效抑制动脉硬化[5]，但由于中药复方对治疗动脉粥样硬化具有多途径、多靶点的特点。因此，我们将通过动物实验，进一步研究化痰法中常用对药陈皮半夏合用是否能通过干预VCAM-1和MMP-9的途径治疗颈动脉粥样硬化。
1 材料与方法
1.1 动物
雄性新西兰白兔，体质量2000～2200 g，购自北京开源兔业养殖场，合格证号：SCXK（京）2006-0005。
1.2 药物
陈皮、半夏按照1∶1配伍，蒸馏水泡2 h，常法煎煮2次，每次40 min，滤出，60 ℃恒温箱内24 h，水浴蒸发浓缩至100%，4 ℃储存备用。
1.3 分组与给药
新西兰白兔造模前以基础饲料适应性喂养1周，在稳定其血脂水平和代谢状况后，按照随机数字表法分为正常组、模型组及中药大、中、小剂量组，每组5只。正常组给予基础饲料喂饲，其余各组给予高脂饲料喂饲（2%胆固醇+2%猪油+96%基础饲料）。除正常组外，动物在喂饲1周后实施颈动脉内膜空气干燥术，术后中药大、中、小剂量组家兔按10、8、6 mL/kg剂量予陈皮半夏煎剂灌胃，每日1次，连续4周。所有动物均单笼喂饲，饮水不限，每日每只进食150 g饲料。
1.4 颈总动脉内膜空气干燥术
10%水合氯醛（剂量为5 mL/kg）灌肠后，颈部脱毛消毒；颈部正中纵行切口，钝性分离，暴露两侧颈总动脉，分离右侧颈总动脉，长度约2 cm；用动脉夹临时夹闭右侧颈总动脉近心端和远心端后用皮试针头于近心端夹闭外近刺入管腔，再在远心端刺破颈总动脉；将抽有生理盐水的注射器连接于皮试针头，用生理盐水灌洗血管腔，然后将医用氮气连接于皮试针头向夹闭段的颈总动脉行空气干燥术，以120 mL/min进行干燥，时间10 min；干燥术后拔出皮试针头，松开动脉夹，恢复右侧颈总动脉的血流，用棉签轻压伤口，待完全止血后去掉棉签，轻压2 min；待颈总动脉完全止血且血流通畅后用庆大霉素局部抗感染，并缝合皮肤。
1.5 HE染色观察颈动脉病理改变
干预4周后处死家兔，截取右侧颈动脉远端1 cm，中性缓冲福尔马林（pH 7.4）固定24 h后脱水，石蜡包埋固定，4 ?m厚连续切片，60～62 ℃烘箱（DHG-9140A型电热恒温箱）烤片2 h后行HE染色。每个标本随机选取3张切片，观察病理改变。
1.6 免疫组织化学染色
每个标本随机取5张石蜡切片，应用免疫组化SABC法（免疫组化PV 9000试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司），参照试剂盒说明书操作。阳性着色为内皮表面棕褐色反应产物沉积，呈胞浆染色，一抗分别为1∶200鼠抗兔VCAM-1多克隆抗体和1∶200鼠抗兔MMP-9多克隆抗体（购自Cell Signaling公司），以PBS代替一抗作空白对照组。每张切片随机选取3个视野（×400），计算机图像扫描定量分析平均光密度（OD）值。
1.7 统计学方法
采用SPSS18统计软件进行分析。实验结果以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 颈动脉HE染色结果
正常组颈动脉血管内膜完整，中膜为梭形平滑肌细胞。模型组有粥样斑块形成，内膜明显增厚，内膜下有大量泡沫细胞堆积；中药组内膜轻度增生，内膜下仅有少量的泡沫细胞形成，程度轻于模型组。表明颈动脉粥样硬化模型制作成功，陈皮半夏合用对颈动脉粥样硬化具有一定的干预作用。 2.2 颈动脉免疫组织化学染色结果
正常组血管壁有少量VCAM-1和MMP-9阳性表达细胞。模型组血管壁泡沫细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的胞浆中有VCAM-1和MMP-9强阳性表达，显著高于对照组（P<0.01）。中药组细胞内VCAM-1和MMP-9阳性表达显著低于模型组（P<0.01），且随着剂量增加，中药对VCAM-1和MMP-9的抑制显著增强（P<0.01）。见表1、图1。
3 讨论
VCAM-1属于免疫球蛋白超家族，是内皮细胞活化的标志之一。在中性粒细胞迁移和内皮细胞黏附导致动脉硬化的过程中起了重要作用[6]。当病变局部的细胞因子释放时，血管内皮细胞被激活，并表达VCAM-1，可以促进和加速动脉粥样硬化的发生和发展。MMPs是锌依赖性蛋白水解酶，是体内的重要金属酶之一。它是造成冠脉斑块破裂的主要内在因素。MMP-9是MMPs中分子量最大的一种，它主要由炎性细胞合成分泌，其过度表达在血管重构中起了重要作用，可导致斑块破裂。因此VCAM-l和MMP-9与动脉硬化的发生、发展有着重要关联。
实验中发现，受损动脉的VCAM-1和MMP-9表达明显增加，说明它们参与了血管损伤过程，是颈动脉硬化的重要信号通路。陈皮半夏对药合用可以有效抑制颈动脉硬化过程中VCAM-1和MMP-9的表达，表明此对药可能通过抑制血管的炎性反应和稳定斑块等途径以达到治疗动脉硬化的目的。
中医经典文献中并无“动脉粥样硬化”的记载，但依据其典型的临床表现，该病应属于“眩晕”、“头痛”等范畴，认为系水谷精微由清化浊，变生痰浊，邪留血脉之中，凝聚成块，如《医学正传》云：“津液稠黏，为痰为饮，积久渗入脉中，血为之浊。”另一方面，痰借血体，血借痰凝，相互博结，凝于血脉，日久胶结不解，如《血证论》云：“血积既久，亦能化为痰水。”因此，痰浊内阻是动脉粥样硬化疾病形成的一个重要病理基础和致病因素[7]。因此，临床上将化痰法在动脉硬化治疗中加以运用，取得了一定的疗效。
而复方作为中药临床用药的主要形式，虽然体现了中医药“辨证施治”的治疗思想和原则，但是关于中药复方作用的物质基础研究则比较困难。对药作为处方配伍应用中相对固定的成对出现的药物，是中药复方的最简单、最基本的形式，其既具有复方的特性，又具有单味中药成分相对简单便于研究的特点，体现着中药方剂适证化裁、灵活加减的应用特点。陈皮半夏作为临床常用的化痰对药，具有燥湿化痰的功效，临床应用非常广泛。现有研究表明，半夏和陈皮的主要成分分别是β-谷甾醇和陈皮苷，而这两者均能抑制黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤体系中产生的超氧阴离子，其清除自由基的能力在一定浓度范围内随着药物浓度的增大而增强，且β谷甾醇和陈皮苷具有明显的协同作用[8]。由于β谷甾醇和陈皮苷都是良好的抗氧化剂，且能较好地清除自由基，而自由基可以介导JNK磷酸化，并与衰老、动脉粥样硬化和炎性反应等有关；而且β-谷甾醇和陈皮苷均有较好的抗炎性反应作用[9-10]。
本实验中根据陈皮和半夏的临床日用量，以等效剂量为标准作为中剂量，以2倍等比级数分别确定为大、小剂量。实验结果表明，随着药物剂量的增加，陈皮半夏对VCAM-1和MMP-9的抑制逐渐增强，说明药效呈剂量依赖性。但值得注意的是，半夏有一定的毒性，临床上常使用法半夏，经过炮制后毒性较小，但过量服用也可能对口腔、喉头、消化道黏膜产生强烈刺激。因此，在追求提高临床疗效的同时，需要在中医理论指导下，通过合理配伍和炮制应用，降低中药的不良反应。
总体看来，陈皮半夏对药可能是通过抑制血管炎性反应、稳定斑块等多种渠道而发挥作用。针对陈皮半夏这种经典的对药开展研究必然对深入探讨复方作用机制具有重要的意义，并可为复方配伍的原理、作用的物质基础和科学内涵的阐明提供一个切入点。
参考文献：
[1] Markus HS， Labrum R， Bevan S， et al. Genetic and acquired inflammatory conditions are synergistically associated with early carotid atherosclerosis[J]. Stroke，2006，37（9）：2253-2259.
[2] Andaluz N， Zuccarello M. Place of drug therapy in the treatment of carotid stenosis[J]. CNS Drugs，2005，19（7）：597-622.
[3] Tuttolomondo A， Di Raimondo D， Pecoraro R， et al. Atherosclerosis as an inflammatory disease[J]. Curr Pharm Des， 2012，18（28）：4266-4288..
[4] Shon SM， Park JH， Nahrendorf M， et al. Exercise attenuates matrix metalloproteinase activity in preexisting atherosclerotic plaque[J]. Atherosclerosis，2011，216（1）：67-73.
[5] Huang X， Wang F， Chen W， et al. Dao-Tan decoction inhibits tumor necrosis factor-α-induced intercellular adhesion molecule-1 expression by blocking JNK and p38 signaling pathways in human umbilical vein endothelial cells[J]. Pharm Biol，2012，50（9）：1111-1117.
[6] Shimizu N， Suzuki H， Wakabayashi K， et al. Expression of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in the pig coronary artery injury model：comparison of plain old balloon angioplasty and stent implantation[J]. J Cardiol，2004，43（3）：131-139.
[7] 陈文强，李宗信，黄小波，等.影响脑动脉硬化患者痰证的多因素分析[J].中国老年学杂志，2006，26（12）：1618-1619.
[8] 刘慧琼，郭书好，沈英森，等.半夏中β谷甾醇的抗氧化作用研究[J].广东药学院学报，2004，19（3）：281-283.
[9] Gupta P， Balwani S， Kumar S， et al. Beta-sitosterol among other secondary metabolites of Piper galeatum shows inhibition of TNFalpha-induced cell adhesion molecule expression on human endothelial cells[J]. Biochimie，2010，92（9）：1213-1221.
[10] Jain M， Parmar HS. Evaluation of antioxidative and anti- inflammatory potential of hesperidin and naringin on the rat air pouch model of inflammation[J]. Inflamm Res，2011，60（5）：483-491.
（收稿日期：2013-03-04，编辑：华强）
关键词：陈皮；半夏；颈动脉硬化；血管细胞黏附分子-1；基质金属蛋白酶-9；兔
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2013.11.013
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2013）11-0034-03
颈动脉硬化是全身性动脉硬化的一部分，其病因尚未完全阐明。流行病学调查显示其主要危险因素有年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病及高血脂症等。目前学者普遍认为颈动脉硬化是由于致伤因素和血管反应之间复杂的相互作用的结果[1]。颈动脉硬化的形成悄无声息，但它是引起脑梗死的重要危险因素。严重颈动脉硬化者即使在药物的干预下，脑卒中的发生率仍为15%～20%[2]。颈动脉硬化形成过程中，血管细胞黏附分子-1
基金项目：国家自然科学基金（30801481，81102624）；北京市科技新星项目（2008A090）；北京市中医药科技项目（JJ2009-037）
通讯作者：黄小波，E-mail：huangxiaobo@bjgn.org
（VCAM-1）介导的炎症反应和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）对动脉硬化斑块的稳定等起到了极其重要的作用[3-4]。本课题组前期研究中发现化痰法能有效抑制动脉硬化[5]，但由于中药复方对治疗动脉粥样硬化具有多途径、多靶点的特点。因此，我们将通过动物实验，进一步研究化痰法中常用对药陈皮半夏合用是否能通过干预VCAM-1和MMP-9的途径治疗颈动脉粥样硬化。
1 材料与方法
1.1 动物
雄性新西兰白兔，体质量2000～2200 g，购自北京开源兔业养殖场，合格证号：SCXK（京）2006-0005。
1.2 药物
陈皮、半夏按照1∶1配伍，蒸馏水泡2 h，常法煎煮2次，每次40 min，滤出，60 ℃恒温箱内24 h，水浴蒸发浓缩至100%，4 ℃储存备用。
1.3 分组与给药
新西兰白兔造模前以基础饲料适应性喂养1周，在稳定其血脂水平和代谢状况后，按照随机数字表法分为正常组、模型组及中药大、中、小剂量组，每组5只。正常组给予基础饲料喂饲，其余各组给予高脂饲料喂饲（2%胆固醇+2%猪油+96%基础饲料）。除正常组外，动物在喂饲1周后实施颈动脉内膜空气干燥术，术后中药大、中、小剂量组家兔按10、8、6 mL/kg剂量予陈皮半夏煎剂灌胃，每日1次，连续4周。所有动物均单笼喂饲，饮水不限，每日每只进食150 g饲料。
1.4 颈总动脉内膜空气干燥术
10%水合氯醛（剂量为5 mL/kg）灌肠后，颈部脱毛消毒；颈部正中纵行切口，钝性分离，暴露两侧颈总动脉，分离右侧颈总动脉，长度约2 cm；用动脉夹临时夹闭右侧颈总动脉近心端和远心端后用皮试针头于近心端夹闭外近刺入管腔，再在远心端刺破颈总动脉；将抽有生理盐水的注射器连接于皮试针头，用生理盐水灌洗血管腔，然后将医用氮气连接于皮试针头向夹闭段的颈总动脉行空气干燥术，以120 mL/min进行干燥，时间10 min；干燥术后拔出皮试针头，松开动脉夹，恢复右侧颈总动脉的血流，用棉签轻压伤口，待完全止血后去掉棉签，轻压2 min；待颈总动脉完全止血且血流通畅后用庆大霉素局部抗感染，并缝合皮肤。
1.5 HE染色观察颈动脉病理改变
干预4周后处死家兔，截取右侧颈动脉远端1 cm，中性缓冲福尔马林（pH 7.4）固定24 h后脱水，石蜡包埋固定，4 ?m厚连续切片，60～62 ℃烘箱（DHG-9140A型电热恒温箱）烤片2 h后行HE染色。每个标本随机选取3张切片，观察病理改变。
1.6 免疫组织化学染色
每个标本随机取5张石蜡切片，应用免疫组化SABC法（免疫组化PV 9000试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司），参照试剂盒说明书操作。阳性着色为内皮表面棕褐色反应产物沉积，呈胞浆染色，一抗分别为1∶200鼠抗兔VCAM-1多克隆抗体和1∶200鼠抗兔MMP-9多克隆抗体（购自Cell Signaling公司），以PBS代替一抗作空白对照组。每张切片随机选取3个视野（×400），计算机图像扫描定量分析平均光密度（OD）值。
1.7 统计学方法
采用SPSS18统计软件进行分析。实验结果以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 颈动脉HE染色结果
正常组颈动脉血管内膜完整，中膜为梭形平滑肌细胞。模型组有粥样斑块形成，内膜明显增厚，内膜下有大量泡沫细胞堆积；中药组内膜轻度增生，内膜下仅有少量的泡沫细胞形成，程度轻于模型组。表明颈动脉粥样硬化模型制作成功，陈皮半夏合用对颈动脉粥样硬化具有一定的干预作用。 2.2 颈动脉免疫组织化学染色结果
正常组血管壁有少量VCAM-1和MMP-9阳性表达细胞。模型组血管壁泡沫细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的胞浆中有VCAM-1和MMP-9强阳性表达，显著高于对照组（P<0.01）。中药组细胞内VCAM-1和MMP-9阳性表达显著低于模型组（P<0.01），且随着剂量增加，中药对VCAM-1和MMP-9的抑制显著增强（P<0.01）。见表1、图1。
3 讨论
VCAM-1属于免疫球蛋白超家族，是内皮细胞活化的标志之一。在中性粒细胞迁移和内皮细胞黏附导致动脉硬化的过程中起了重要作用[6]。当病变局部的细胞因子释放时，血管内皮细胞被激活，并表达VCAM-1，可以促进和加速动脉粥样硬化的发生和发展。MMPs是锌依赖性蛋白水解酶，是体内的重要金属酶之一。它是造成冠脉斑块破裂的主要内在因素。MMP-9是MMPs中分子量最大的一种，它主要由炎性细胞合成分泌，其过度表达在血管重构中起了重要作用，可导致斑块破裂。因此VCAM-l和MMP-9与动脉硬化的发生、发展有着重要关联。
实验中发现，受损动脉的VCAM-1和MMP-9表达明显增加，说明它们参与了血管损伤过程，是颈动脉硬化的重要信号通路。陈皮半夏对药合用可以有效抑制颈动脉硬化过程中VCAM-1和MMP-9的表达，表明此对药可能通过抑制血管的炎性反应和稳定斑块等途径以达到治疗动脉硬化的目的。
中医经典文献中并无“动脉粥样硬化”的记载，但依据其典型的临床表现，该病应属于“眩晕”、“头痛”等范畴，认为系水谷精微由清化浊，变生痰浊，邪留血脉之中，凝聚成块，如《医学正传》云：“津液稠黏，为痰为饮，积久渗入脉中，血为之浊。”另一方面，痰借血体，血借痰凝，相互博结，凝于血脉，日久胶结不解，如《血证论》云：“血积既久，亦能化为痰水。”因此，痰浊内阻是动脉粥样硬化疾病形成的一个重要病理基础和致病因素[7]。因此，临床上将化痰法在动脉硬化治疗中加以运用，取得了一定的疗效。
而复方作为中药临床用药的主要形式，虽然体现了中医药“辨证施治”的治疗思想和原则，但是关于中药复方作用的物质基础研究则比较困难。对药作为处方配伍应用中相对固定的成对出现的药物，是中药复方的最简单、最基本的形式，其既具有复方的特性，又具有单味中药成分相对简单便于研究的特点，体现着中药方剂适证化裁、灵活加减的应用特点。陈皮半夏作为临床常用的化痰对药，具有燥湿化痰的功效，临床应用非常广泛。现有研究表明，半夏和陈皮的主要成分分别是β-谷甾醇和陈皮苷，而这两者均能抑制黄嘌呤氧化酶/次黄嘌呤体系中产生的超氧阴离子，其清除自由基的能力在一定浓度范围内随着药物浓度的增大而增强，且β谷甾醇和陈皮苷具有明显的协同作用[8]。由于β谷甾醇和陈皮苷都是良好的抗氧化剂，且能较好地清除自由基，而自由基可以介导JNK磷酸化，并与衰老、动脉粥样硬化和炎性反应等有关；而且β-谷甾醇和陈皮苷均有较好的抗炎性反应作用[9-10]。
本实验中根据陈皮和半夏的临床日用量，以等效剂量为标准作为中剂量，以2倍等比级数分别确定为大、小剂量。实验结果表明，随着药物剂量的增加，陈皮半夏对VCAM-1和MMP-9的抑制逐渐增强，说明药效呈剂量依赖性。但值得注意的是，半夏有一定的毒性，临床上常使用法半夏，经过炮制后毒性较小，但过量服用也可能对口腔、喉头、消化道黏膜产生强烈刺激。因此，在追求提高临床疗效的同时，需要在中医理论指导下，通过合理配伍和炮制应用，降低中药的不良反应。
总体看来，陈皮半夏对药可能是通过抑制血管炎性反应、稳定斑块等多种渠道而发挥作用。针对陈皮半夏这种经典的对药开展研究必然对深入探讨复方作用机制具有重要的意义，并可为复方配伍的原理、作用的物质基础和科学内涵的阐明提供一个切入点。
参考文献：
[1] Markus HS， Labrum R， Bevan S， et al. Genetic and acquired inflammatory conditions are synergistically associated with early carotid atherosclerosis[J]. Stroke，2006，37（9）：2253-2259.
[2] Andaluz N， Zuccarello M. Place of drug therapy in the treatment of carotid stenosis[J]. CNS Drugs，2005，19（7）：597-622.
[3] Tuttolomondo A， Di Raimondo D， Pecoraro R， et al. Atherosclerosis as an inflammatory disease[J]. Curr Pharm Des， 2012，18（28）：4266-4288..
[4] Shon SM， Park JH， Nahrendorf M， et al. Exercise attenuates matrix metalloproteinase activity in preexisting atherosclerotic plaque[J]. Atherosclerosis，2011，216（1）：67-73.
[5] Huang X， Wang F， Chen W， et al. Dao-Tan decoction inhibits tumor necrosis factor-α-induced intercellular adhesion molecule-1 expression by blocking JNK and p38 signaling pathways in human umbilical vein endothelial cells[J]. Pharm Biol，2012，50（9）：1111-1117.
[6] Shimizu N， Suzuki H， Wakabayashi K， et al. Expression of intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in the pig coronary artery injury model：comparison of plain old balloon angioplasty and stent implantation[J]. J Cardiol，2004，43（3）：131-139.
[7] 陈文强，李宗信，黄小波，等.影响脑动脉硬化患者痰证的多因素分析[J].中国老年学杂志，2006，26（12）：1618-1619.
[8] 刘慧琼，郭书好，沈英森，等.半夏中β谷甾醇的抗氧化作用研究[J].广东药学院学报，2004，19（3）：281-283.
[9] Gupta P， Balwani S， Kumar S， et al. Beta-sitosterol among other secondary metabolites of Piper galeatum shows inhibition of TNFalpha-induced cell adhesion molecule expression on human endothelial cells[J]. Biochimie，2010，92（9）：1213-1221.
[10] Jain M， Parmar HS. Evaluation of antioxidative and anti- inflammatory potential of hesperidin and naringin on the rat air pouch model of inflammation[J]. Inflamm Res，2011，60（5）：483-491.
（收稿日期：2013-03-04，编辑：华强）