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摘要：以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）HX2105为生产菌株，研究了不同碳源，不同初糖浓度以及不同的补糖策略对L-丝氨酸发酵的影响，结果表明以蔗糖为碳源对HXV2105发酵生产L-丝氨酸的效果最好，在100g/L的初糖浓度下，L-丝氨酸发酵产量达到了13.05 g/L。通过连续流加补糖策略，使蔗糖浓度在15～25g/L之间维持相对稳定，10L罐发酵96h L-丝氨酸产量达到了25.55g/L。
关键词：L-丝氨酸 碳源 发酵 补糖策略
中图分类号：TS2；Q815 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）08-0000-00
丝氨酸，又名蚕丝氨酸，最初由蚕丝蛋白水解分离所得，虽然属于非必需氨基酸，但作为构成蛋白质的常见氨基酸之一，丝氨酸具有许多重要的生理功能和作用，在饲料、农业、食品、药品、化妆品工业中都有广泛的应用。目前生产丝氨酸的方法主要有，化学合成法、水解提取法、酶法、添加前体物发酵法、糖质原料直接发酵法。丝氨酸发酵法的研究报告主要集中在添加前体物发酵法上，甘油酸盐（或酯）、甘油酸三甲内盐、甘氨酸被认为是发酵合成丝氨酸最有前景的前体物[1]。左爱莲等[2]利用甘氨酸为前体物的发酵，丝氨酸产量达到了7.5g/L，但作为前体物的甘氨酸价格昂贵，通过添加甘氨酸等前体发酵法生产丝氨酸不能满足快速增长的市场需求。而直接发酵法利用糖质原料为碳源，不仅原料供应充足，而且价格相对低廉，是L-丝氨酸生产的重要方向。研究以糖质为碳源对L-丝氨酸发酵的影响，对于提高丝氨酸产量，降低低丝氨酸生产成本，进行规模化生产具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 菌种
谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）HX2105为广东环西生物科技股份有限公司技术中心菌种室保藏菌种。
1.2 培养基
1.2.1 种子培养基（g/L）
葡萄糖30.0，磷酸二氢钾1.5，七水硫酸镁0.6，硫酸锰0.02，玉米浆干粉4.0，酵母粉3.0，VH 0.00015，VB1 0.00045，pH7.0～7.2；121℃灭菌20分钟。
1.2.1 发酵基础培养基（g/L）
磷酸二氢钾2.5，七水硫酸镁0.8，VH0.00015，VB1 0.00040，硫酸锰0.03，硫酸亚铁0.5，硫酸铵25.0，玉米浆干粉2.5，pH7.0～7.2；121℃灭菌20分钟。
1.3 分析检测
1.3.1 丝氨酸含量的测定：采用高效液相色谱仪测定[3]
1.3.2 菌体生物量（以菌体干重DCW表示）的测定[3]
发酵液用0.25mol/L盐酸稀释50倍，562nm测光密度，按1OD=0.27g/L DCW换算为菌体干重。
1.3.3 发酵液中蔗糖的测定：间苯二酚法测定[4]
2 结果与讨论
2.1 不同碳源对丝氨酸发酵的影响
以发酵基础培养基为基础，研究不同糖质原料碳源对菌株HX2105生长和L-丝氨酸发酵产量的影响，如图1所示。从图中可以看出，以麦芽糖，乳糖，可溶性淀粉等糖质原料为碳源时，菌体生长很弱，L-Ser产量也很小。而以葡萄糖为碳源时，虽然菌体生长较前麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉等糖质碳源好，但L-Ser产量没有明显增加。而以果糖和蔗糖为碳源时菌体生长和L-Ser产量都有显著增加，其中以蔗糖为碳源时效果最好，菌体生物量和产酸分别达到了10.9g/L，13.8g/L，与文献[5，6]以蔗糖为最优碳源的研究结果是一致的。
2.2 初糖浓度对丝氨酸发酵的影响
合适的初糖浓度不仅能为菌体生长提供充足的碳源与合成产物所需的碳骨架[7]，还能调节发酵液的粘度，维持参透压，有利于菌体生长，不同初始蔗糖浓度对于L-Ser发酵的影响结果如图2所示。从图中可以看出，随着蔗糖浓度的增加，菌体的生物量和L-Ser产量都逐步提高，初糖浓度达到100g/L时生物量和产酸达到了最大值，分别为10.13g/L，13.05g/L。随着初糖浓度的进一步增加，菌体生物量和L-Ser逐渐下降，最适初糖浓度为100g/L。
2.3 糖浓度的控制与补糖策略研究
2.3.1 糖浓度的控制
发酵进入到菌体转化期和丝氨酸积累期以后，合适的糖浓度对于进一步维持细胞内外的渗透压，促进细胞内外的快速物质交换有重要作用，有利于产物的快速生成与积累。实验研究了从5～40g/L的糖浓度下，菌体生物量和L-丝氨酸产量的变化情况，结果如表1所示。从表中可以看出，糖浓度在15～25g/L时菌体生物量与L-丝氨酸的产量最大。浓度过低，合成L-丝氨酸碳骨架的流量减少，从而影响丝氨酸的积累。糖浓度过高，则影响发酵液的渗透压，从而影响产物的合成与释放。所以在L-丝氨酸发酵产酸期，蔗糖浓度在15～25g/L之间为宜。
2.3.2 补糖策略的研究
随着发酵进入对数生长期和产物的快速生成，糖的消耗加快，为了使产酸期的残糖浓度能控制在15～25g/L间，以维持菌体生长和促进产物生成，需要向发酵液补加蔗糖。三种不同补糖模式和策略对L-丝氨酸发酵的影响如图3、4、5所示。实验发现，一次性补糖模式（图3），补糖后糖浓度急剧升高，菌体生长受到抑制，产酸明显变慢，使发酵周期延长，此种补糖策略不利于提高产酸。分批补糖模式（图4）对于菌体生长的抑制不显著，但糖浓度波动幅度较大，受糖浓度大幅波动影响，产酸变慢，终产量较低，对生产不利。最好的补糖模式是通过连续流的策略使蔗糖浓度维持相对稳定（图5），降低糖浓度波动带来的不利影响，此种模式下，菌体生物量和L-丝氨酸产量分别为14.82g/L，25.55g/L，达到最大值。
3结语
在多种碳源中，对L-丝氨酸发酵最好的碳源是蔗糖，最合适的初糖浓度是100g/L，通过流加的方式补加一定量的蔗糖，使糖浓度维持在15～25g/L时，对于L-丝氨酸发酵最有利，在此模式下，菌体生物量和产酸达到最大值，分别为14.82g/L，25.55 g/L。
参考文献
[1]张炳荣.氨基酸生产技术讲座[J].中国调味品，1986，22：28-32.
[2]左爱连，张伟国.L-丝氨酸高产菌的选育及其发酵条件[J].化工进展，2008，09：1408-1411.
[3]林琳.利用糖质原料产L-丝氨酸菌株SYPS-062的代谢机制初探[D].江南大学，2008.
[4]刘万红，刘爱福，李文鑫等.丝氨酸羟甲转移酶基因的功能表达及其活性鉴定[J].食品与发酵工业，2001，28（1）：5-8.
[5]左爱连.L-丝氨酸产生菌的选育及其发酵条件的研究[D].江南大学，2008.
[6]张晓梅，窦文芳，许泓瑜，许正宏. 产L-丝氨酸菌株SYPS-062的鉴定及碳源对发酵的影响[J]. 微生物学通报，2009，06：789-793.
[7]浦军平，庄国英，顾岳良，陈刚. 低糖流加法生产L-缬氨酸发酵工艺条件的研究[J]. 氨基酸和生物资源，2003，04：48-51.
收稿日期：2015-04-25
作者简介：陈伟波（1982—）男（汉族），广东普宁人，本科学士，助理工程师，主要从事氨基酸发酵行业工作和食品生物技术方向研究。
关键词：L-丝氨酸 碳源 发酵 补糖策略
中图分类号：TS2；Q815 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）08-0000-00
丝氨酸，又名蚕丝氨酸，最初由蚕丝蛋白水解分离所得，虽然属于非必需氨基酸，但作为构成蛋白质的常见氨基酸之一，丝氨酸具有许多重要的生理功能和作用，在饲料、农业、食品、药品、化妆品工业中都有广泛的应用。目前生产丝氨酸的方法主要有，化学合成法、水解提取法、酶法、添加前体物发酵法、糖质原料直接发酵法。丝氨酸发酵法的研究报告主要集中在添加前体物发酵法上，甘油酸盐（或酯）、甘油酸三甲内盐、甘氨酸被认为是发酵合成丝氨酸最有前景的前体物[1]。左爱莲等[2]利用甘氨酸为前体物的发酵，丝氨酸产量达到了7.5g/L，但作为前体物的甘氨酸价格昂贵，通过添加甘氨酸等前体发酵法生产丝氨酸不能满足快速增长的市场需求。而直接发酵法利用糖质原料为碳源，不仅原料供应充足，而且价格相对低廉，是L-丝氨酸生产的重要方向。研究以糖质为碳源对L-丝氨酸发酵的影响，对于提高丝氨酸产量，降低低丝氨酸生产成本，进行规模化生产具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 菌种
谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）HX2105为广东环西生物科技股份有限公司技术中心菌种室保藏菌种。
1.2 培养基
1.2.1 种子培养基（g/L）
葡萄糖30.0，磷酸二氢钾1.5，七水硫酸镁0.6，硫酸锰0.02，玉米浆干粉4.0，酵母粉3.0，VH 0.00015，VB1 0.00045，pH7.0～7.2；121℃灭菌20分钟。
1.2.1 发酵基础培养基（g/L）
磷酸二氢钾2.5，七水硫酸镁0.8，VH0.00015，VB1 0.00040，硫酸锰0.03，硫酸亚铁0.5，硫酸铵25.0，玉米浆干粉2.5，pH7.0～7.2；121℃灭菌20分钟。
1.3 分析检测
1.3.1 丝氨酸含量的测定：采用高效液相色谱仪测定[3]
1.3.2 菌体生物量（以菌体干重DCW表示）的测定[3]
发酵液用0.25mol/L盐酸稀释50倍，562nm测光密度，按1OD=0.27g/L DCW换算为菌体干重。
1.3.3 发酵液中蔗糖的测定：间苯二酚法测定[4]
2 结果与讨论
2.1 不同碳源对丝氨酸发酵的影响
以发酵基础培养基为基础，研究不同糖质原料碳源对菌株HX2105生长和L-丝氨酸发酵产量的影响，如图1所示。从图中可以看出，以麦芽糖，乳糖，可溶性淀粉等糖质原料为碳源时，菌体生长很弱，L-Ser产量也很小。而以葡萄糖为碳源时，虽然菌体生长较前麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉等糖质碳源好，但L-Ser产量没有明显增加。而以果糖和蔗糖为碳源时菌体生长和L-Ser产量都有显著增加，其中以蔗糖为碳源时效果最好，菌体生物量和产酸分别达到了10.9g/L，13.8g/L，与文献[5，6]以蔗糖为最优碳源的研究结果是一致的。
2.2 初糖浓度对丝氨酸发酵的影响
合适的初糖浓度不仅能为菌体生长提供充足的碳源与合成产物所需的碳骨架[7]，还能调节发酵液的粘度，维持参透压，有利于菌体生长，不同初始蔗糖浓度对于L-Ser发酵的影响结果如图2所示。从图中可以看出，随着蔗糖浓度的增加，菌体的生物量和L-Ser产量都逐步提高，初糖浓度达到100g/L时生物量和产酸达到了最大值，分别为10.13g/L，13.05g/L。随着初糖浓度的进一步增加，菌体生物量和L-Ser逐渐下降，最适初糖浓度为100g/L。
2.3 糖浓度的控制与补糖策略研究
2.3.1 糖浓度的控制
发酵进入到菌体转化期和丝氨酸积累期以后，合适的糖浓度对于进一步维持细胞内外的渗透压，促进细胞内外的快速物质交换有重要作用，有利于产物的快速生成与积累。实验研究了从5～40g/L的糖浓度下，菌体生物量和L-丝氨酸产量的变化情况，结果如表1所示。从表中可以看出，糖浓度在15～25g/L时菌体生物量与L-丝氨酸的产量最大。浓度过低，合成L-丝氨酸碳骨架的流量减少，从而影响丝氨酸的积累。糖浓度过高，则影响发酵液的渗透压，从而影响产物的合成与释放。所以在L-丝氨酸发酵产酸期，蔗糖浓度在15～25g/L之间为宜。
2.3.2 补糖策略的研究
随着发酵进入对数生长期和产物的快速生成，糖的消耗加快，为了使产酸期的残糖浓度能控制在15～25g/L间，以维持菌体生长和促进产物生成，需要向发酵液补加蔗糖。三种不同补糖模式和策略对L-丝氨酸发酵的影响如图3、4、5所示。实验发现，一次性补糖模式（图3），补糖后糖浓度急剧升高，菌体生长受到抑制，产酸明显变慢，使发酵周期延长，此种补糖策略不利于提高产酸。分批补糖模式（图4）对于菌体生长的抑制不显著，但糖浓度波动幅度较大，受糖浓度大幅波动影响，产酸变慢，终产量较低，对生产不利。最好的补糖模式是通过连续流的策略使蔗糖浓度维持相对稳定（图5），降低糖浓度波动带来的不利影响，此种模式下，菌体生物量和L-丝氨酸产量分别为14.82g/L，25.55g/L，达到最大值。
3结语
在多种碳源中，对L-丝氨酸发酵最好的碳源是蔗糖，最合适的初糖浓度是100g/L，通过流加的方式补加一定量的蔗糖，使糖浓度维持在15～25g/L时，对于L-丝氨酸发酵最有利，在此模式下，菌体生物量和产酸达到最大值，分别为14.82g/L，25.55 g/L。
参考文献
[1]张炳荣.氨基酸生产技术讲座[J].中国调味品，1986，22：28-32.
[2]左爱连，张伟国.L-丝氨酸高产菌的选育及其发酵条件[J].化工进展，2008，09：1408-1411.
[3]林琳.利用糖质原料产L-丝氨酸菌株SYPS-062的代谢机制初探[D].江南大学，2008.
[4]刘万红，刘爱福，李文鑫等.丝氨酸羟甲转移酶基因的功能表达及其活性鉴定[J].食品与发酵工业，2001，28（1）：5-8.
[5]左爱连.L-丝氨酸产生菌的选育及其发酵条件的研究[D].江南大学，2008.
[6]张晓梅，窦文芳，许泓瑜，许正宏. 产L-丝氨酸菌株SYPS-062的鉴定及碳源对发酵的影响[J]. 微生物学通报，2009，06：789-793.
[7]浦军平，庄国英，顾岳良，陈刚. 低糖流加法生产L-缬氨酸发酵工艺条件的研究[J]. 氨基酸和生物资源，2003，04：48-51.
收稿日期：2015-04-25
作者简介：陈伟波（1982—）男（汉族），广东普宁人，本科学士，助理工程师，主要从事氨基酸发酵行业工作和食品生物技术方向研究。